油棕脫落酸受體PYL基因家族的全基因組鑒定及表達分析

金龍飛 尹欣幸 曹紅星

摘要：【目的】鑒定油棕（Elaeis guineensis）脫落酸（ABA）受體PYR/PYL/RCARs（PYL）基因家族成員，分析其表達特性，為探究ABA信號通路在油棕果肉成熟過程中的功能研究提供理論依據。【方法】以擬南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列作為參考序列，通過BLASTp比對及保守結構域預測分析從油棕基因組中鑒定出PYL基因家族成員，利用生物信息學軟件對其染色體定位、基因結構、啟動子順式作用元件及編碼蛋白的理化性質、保守結構域、進化關系進行分析，并采用實時熒光定量PCR對PYL家族基因在不同組織、不同發育期果實及外源ABA處理下的表達特性進行檢測。【結果】從油棕基因組中共鑒定出12個油棕PYL基因家族成員（EgPYL1～EgPYL112），分布在8條染色體和1個Scaffolds上，含有1～3個外顯子，開放閱讀框（ORF）為564～765 bp，編碼187～254個氨基酸，蛋白分子量為20.95～28.33 kD，等電點（pI）為5.26～7.95，不穩定指數為32.67～52.87，脂溶指數為73.87～87.60，總平均親水性為-0.68～-0.17。12個PYL家族蛋白均含有特征結構域PYR/PYL/RCAR，分為3個亞族。EgPYL1和EgPYL6基因具有共線性，EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11基因具有共線性。EgPYLs基因的啟動子上含有大量植物激素響應元件、逆境脅迫響應元件和光響應元件。EgPYLs基因在根、莖尖、葉、花和果肉中均有表達，但表達量差異較明顯。EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9基因的表達量隨果肉成熟度增加逐漸升高，在23周達峰值。11個EgPYLs基因均受外源ABA誘導表達。【結論】大多數PYL基因家族成員參與油棕對ABA的響應，且部分成員（如EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9）在油棕果實發育中發揮重要的調控作用。

關鍵詞： 油棕;PYR/PYL/RCARs（PYL）基因家族;脫落酸;生物信息學;基因表達

Abstract：【Objective】In this research，the oil palm（Elaeis guineensis） abscisic acid receptor PYR/PYL/RCARs（PYL） gene family members were identified，and their expression characteristics during fruit development and abscisic acid（ABA） treatment were analyzed，which provided evidence for researching the mechanism of ABA signaling pathway in fruit maturation of oil palm. 【Method】The amino acid sequences of Arabidopsis and rice PYL protein were query sequences， identified PYL gene family members from oil palm genome via BLASTp and conservative domain prediction analysis. The chromosomal location，gene structure，promoter cis-acting elements， protein physicochemical properties，conserved functional domains and evolutionary relationships were analyzed through bioinformatics softwares. The expression characteristics of PYL family gene in different，mesocarp at different stages and ABA treatment were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】 The results showed that 12 PLY （EgPYL1-EgPYL12） gene family members were identified form oil palm genome and were distributed on 8 chromosomes and 1 Scaffolds. The extrons numbers of EgPYL family members were between 1 and 3，the open reading frames（ORF） length were between 564 and 765 pb and encoded amino acid numbers were between 187 and 254. The molecular weights were between 20.95 and 28.33 kD，the isoelectric points were between 5.26 and 7.95，the instability indexes were between 32.67 and 52.87，the aliphatic indexes were between 73.87 and 87.60，the total hydrophilicity was between -0.68 and -0.17. Twelve PYL family protein contained PYR/PYL/RCAR functional domain and were divided into 3 groups based on phylogenetic relationships. Collinearity analysis showed that collinearity existed between EgPYL1 gene and EgPYL6 gene，EgPYL4 gene，EgPYL5 gene，EgPYL9 gene and EgPYL11 gene. A large number of plant hormone responses，stress responses and light responses elements were identified on promoters of EgPYLs gene. Expression analysis of different tissues showed that the EgPYLs gene expressed in roots，shoots，leaves，flowers and fruits， with great difference. During fruit maturation，the expressions of EgPYL7，EgPYL8 and EgPYL9 genes increased gradually and reached the peak at 23 weeks after anthesis. Eleven EgPYLs were induced by exogenous ABA treatment. 【Conclusion】Most PYL gene family members are involved in responding to abscisic acid，among them EgPYL7，EgPYL8 and EgPYL9 genes might play important roles in regulating oil palm mesocarp development.

0 引言

【研究意義】油棕（Elaeis guineensis）是世界上產油效率最高的作物之一，果肉含油率高達50%，每公頃產油量高達4.27 t，是花生的7～8倍、大豆的9～10倍（雷新濤等，2012）。從油棕果實壓榨的棕櫚油廣泛應用于食品加工業、日用化工業、機械潤滑和生物柴油等諸多領域（Mahlia et al.，2019）。油棕果實的含油量隨果實成熟度的增加而增加，成熟期含油量較未成熟期含油量增加79%～95%（殷振華等，2016）。研究發現，油棕果實中ABA含量從花后16周開始迅速上升，到花后21周達到峰值，在花后22周含量略微降低，ABA合成基因NCED1也呈相同的表達特征，表明ABA在油棕果實發育中起著重要的調控作用（Teh et al.，2014;劉艷菊等，2020）。雖然已證實PYR/PYL/RCARs（縮寫為PYL）是ABA信號傳導途徑中最重要的受體蛋白，主要功能是識別ABA信號和啟動信號的傳遞。但對PYL在油棕ABA信號傳導中的作用機制尚不清楚，通過生物信息學方法對油棕PYL基因家族成員進行鑒定，明確其在油棕果實發育及ABA處理下的表達特征，對探究ABA信號通路在油棕成熟過程中的功能及培育高含油量油棕品種具有重要意義。【前人研究進展】ABA是植物響應逆境脅迫、調控氣孔關閉和果實成熟等多個生物學過程的重要激素之一，在植物果實發育中發揮重要的調控作用（Leng et al.，2014;李紅霞，2019;牟望舒，2019）。在無ABA存在的情況下，蛋白磷酸酶2C（PP2C）通過物理相互作用和磷酸酶活性抑制SNF1相關激酶（SnRK2）的活性，使SnRK2s無法啟動下游基因的表達;在ABA存在的情況下，ABA與PYL受體結合導致受體的結構改變，激活PYL與PP2C的相互作用，進而破壞PP2C和SnRK2之間的相互作用，促使SnRK2s啟動下游基因的表達（Ma et al.，2009;Melcher et al.，2009）。可見，PYL受體發揮識別傳遞ABA信號的關鍵功能（Leng et al.，2014;García-Andrade et al.，2020）。Li等（2018）研究發現，擬南芥的AtRCAR12和AtRCAR13基因參與植株對干旱脅迫的應答，即二者過表達可誘導脅迫響應相關基因的表達，提高植株水分利用效率，增強對干旱脅迫的耐受性。Zhang等（2019）研究發現，AtRCAR12和AtRCAR13基因參與對低溫和高溫脅迫的應答，即在高溫脅迫下二者過表達可誘導熱激蛋白HSP18.2和HSP70基因表達，以提高對高溫脅迫的耐受性;在低溫脅迫下二者通過誘導低溫響應轉錄因子基因CBFs的表達提高對低溫脅迫的耐受性。Dittrich等（2019）研究發現，擬南芥的6個PYL家族基因均在保衛細胞中表達，其中，AtPYL2是ABA誘導氣孔關閉的受體，而AtPYL4和AtPYL5是CO2調控氣孔開合的受體。此外，大量研究發現，PYL參與調控植物果實成熟，如香蕉中PYL-PP2C-SnRK2介導的ABA信號通路正向調控香蕉果實成熟（Hu et al.，2017）;在草莓中FaPYL9基因的表達量隨果實成熟迅速升高，抑制FaPYL9基因表達則會延遲果實成熟（顏志明等，2015）;番茄中SlPYL9基因過表達可促進果實成熟，抑制SlPYL9基因則延遲果實成熟（Kai et al.，2019）。【本研究切入點】隨著越來越多植物基因組測序完成，在番茄（Sun et al.，2011;González-Guzmán et al.，2014）、擬南芥（Gonzalez-Guzman et al.，2012）、甜橙（Romero et al.，2012）、油棕（Singh et al.，2013）、棉花（Zhang et al.，2017）、油菜（Di et al.，2018）、煙草（Bai et al.，2019）、水稻（Yadav et al.，2020）等物種中鑒定出PYL基因家族成員，但目前未見有關油棕PYL基因家族成員鑒定分析及其在油棕果肉發育中的表達特性的研究報道。【擬解決的關鍵問題】從油棕基因組中鑒定出PYL基因家族成員，分析其染色體定位、基因結構、啟動子順式作用元件及其編碼蛋白的理化性質、保守結構域、進化關系，并采用實時熒光定量PCR檢測其在不同組織、果肉果實發育期及外源ABA處理下的表達特征，為探究PYL家族基因在油棕生長發育、ABA響應機制中的調控作用及油棕分子育種提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試品種為薄殼種熱油4號油棕，種植于國家熱帶棕櫚種質資源圃（東經110°46′，北緯19°33′）。主要試劑：植物總RNA提取試劑盒（DP432）購自北京天根生化科技有限公司;HiScript II One Step RT-PCR Kit試劑盒（P611）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;實時熒光定量PCR的SYBR? Select Master Mix（4472908）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;ABA（S18006）購自上海源葉生物科技有限公司。主要儀器：移液器（Eppendorf，德國）、NanoDrop分光光度計（Thermo，美國）、高速冷凍離心機（Thermo，美國）、Labcycler PCR儀（SensoQuest，德國）、水平電泳槽（DYCP-32B，北京六一儀器廠）、電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）、QuantStudio 6 Flex實時熒光定量PCR系統（Thermo，美國）。

1. 2 樣品處理及采集

采集5年生薄殼種熱油4號油棕的根、莖尖、葉、花（開花期的雄花和雌花）及花后15、17、21和23周的果肉，用于后續PYL家族基因表達組織特性分析。由于前期研究發現100 μmol/L的ABA能有效增強油棕幼苗的抗寒性，故選用100 μmol/L的ABA對幼苗進行外源ABA處理：選取3月齡生長旺盛且無病蟲害的幼苗，噴施100 μmol/L的ABA溶液（其中添加0.5%吐溫20），分別采集0（對照）、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0和24.0 h的新葉葉片。樣品采集后液氮速凍，于-80 ℃冰箱中保存以備RNA提取。

1. 3 油棕PYL基因家族的挖掘與鑒定

從NCBI數據庫中下載油棕全基因組數據（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/2669）;從TAIR數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥PYL蛋白氨基酸序列;從NCBI數據庫中下載水稻PYL蛋白氨基酸序列。以擬南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列作為參考序列，通過BLASTp在油棕基因組數據中進行比對，并將獲得的蛋白氨基酸序列提交至NCBI數據庫的保守結構域數據庫，利用Batch Web CD-search Tool進行保守結構域分析（Lu et al.，2020），最終確定PYL基因家族成員。采用ExPASy在線工具分析油棕PYL家族蛋白的分子量、等電點、蛋白不穩定指數、脂溶指數和總平均親水性等理化性質。

1. 4 油棕PYL家族基因核苷酸序列分析

采用Tbtool對油棕PYL家族基因的染色體定位、基因結構、共線性分析及保守結構域分析進行可視化（Chen et al.，2020）;采用ClustalW對油棕、擬南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列進行多重比對（Edgar and Batzoglou，2006）;采用MEGA 6.0的鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育進化樹（Kumar et al.，2018;周麗霞和曹紅星，2020），校驗值Bootstrap設置為1000。

1. 5 油棕PYL家族基因啟動子順式作用元件分析

從NCBI數據庫中下載油棕PYL家族基因編碼區上游2000 bp的啟動子序列。利用PlantCare在線工具對啟動子順式作用元件進行鑒定（Lescot et al.，2002）。

1. 6 油棕PYL家族基因的表達分析

采用植物總RNA提取試劑盒提取油棕不同組織和外源ABA處理樣品的總RNA，采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒合成cDNA;采用SYBR? Select Master Mix進行實時熒光定量PCR檢測，以β-actin作為內參基因，引物如表1所示。上述具體步驟均參照試劑盒說明進行。

1. 7 數據分析

采用SPSS 13.0進行數據分析，用Duncan檢測法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 油棕PYL基因家族成員鑒定及染色體定位結果

通過BLASTp比對分析及保守結構域預測，從油棕基因組中共鑒定出12個油棕PYL基因家族成員（EgPYLs），根據其在染色體上位置進行命名，依次命名為EgPYL1～EgPYL12，12個基因的開放閱讀框（ORF）長度為564～765 bp，編碼的氨基酸數量為187～257個（表1）。由圖1可知，12個PYL基因家族成員分布在8條染色體和1個Scaffolds上。其中，EgPYL1和EgPYL2基因在Chr1上，EgPYL3基因在Chr3上，EgPYL4和EgPYL5基因在Chr5上，EgPYL6基因在Chr6上，EgPYL7和EgPYL8基因在Chr7上，EgPYL9基因在Chr10上，EgPYL10基因在Chr11上，EgPYL11基因在Chr14上，EgPYL12基因未能定位到染色體上，而是定位于1條Scaffolds（即NW_011565705.1）上。

2. 2 油棕PYL家族蛋白的理化性質預測結果

由表2可知，12個EgPYLs蛋白的氨基酸數目為187～254個，平均為216個;分子量為20.95～28.33 kD，平均為23.58 kD;等電點（pI）為5.26～7.95，平均為6.81;蛋白不穩定指數為32.67～52.87，平均為43.92，其中，有6個是穩定蛋白（不穩定指數<40.00），有6個是不穩定蛋白（不穩定指數>40.00）;脂溶系數為73.87～87.60，平均為81.53;總平均親水性為-0.68～ -0.17，平均為-0.36，均為負值，表明12個EgPYLs蛋白均表現為親水性。

2. 3 油棕PYL家族基因結構及其編碼蛋白保守結構域和進化關系分析

12個EgPYLs基因的外顯子和內含子差異較大，其中EgPYL1、EgPYL3、EgPYL6和EgPYL8基因有3個外顯子，2個內含子，而其余基因均含有1個外顯子，無內含子（圖2-A）。12個EgPYLs蛋白均含有PYL家族蛋白特有的PYR/PYL/RCAR保守結構域（圖2-B）。為了分析油棕PYL家族基因的系統發育進化關系，將EgPYLs蛋白與擬南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列進行多重比對并構建系統發育進化樹，結果（圖3）顯示，可將3個物種的PYL蛋白分成3個亞族：AtPYL2～AtPYL6、OsPYL2～OsPYL6、EgPYL4、EgPYL5、EgPYL7、EgPYL9和EgPYL11為I亞族，AtPYL7～AtPYL13、OsPYL7～OsPYL13、EgPYL1、EgPYL3、EgPYL6和EgPYL8為II亞族，AtPYL1、AtPYR1、OsPYL1、EgPYL2、EgPYL10和EgPYL12為III亞族。基因共線分析結果顯示，EgPYL1和EgPYL6共線性，EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11共線性（圖4）。

2. 4 油棕PYL基因家族的啟動子順式作用元件的鑒定

在油棕PYL基因家族成員的啟動子中鑒定出大量的順式作用元件，包括生長素響應元件1個、脫落酸響應元件31個、赤霉素響應元件10個、茉莉酸甲酯響應元件20個、水楊酸響應元件8個、低溫響應元件15個、光響應元件48個、防衛和逆境響應元件4個及MYB結合位點14個（表3）;除EgPYL5基因外，其他11個油棕PYL基因家族成員的啟動子均含有脫落酸響應元件，表明EgPYLs基因參與植物激素和環境刺激的應答。

2. 5 油棕PYL家族基因的表達分析結果

由圖5可知，EgPYLs基因在不同組織中的表達量差異較明顯，其中EgPYL5和EgPYL12基因在根中的表達量最高，顯著高于在其他組織中的表達量（P<0.05，下同）;EgPYL1、EgPYL3、EgPYL4、EgPYL6、EgPYL8、EgPYL9和EgPYL11基因在葉中表達量最高，顯著高于在其他組織中的表達量;EgPYL2、EgPYL7和EgPYL10基因在花中表達量最高，其中EgPYL7和EgPYL10基因在花中表達量顯著高于在其他組織中的表達量;EgPYL2基因在果肉（15、17、21和23周的果肉混合樣）中表達量也較高，與在花中表達量無顯著差異（P>0.05），均顯著高于在其他組織中的表達量，表明EgPYLs基因在油棕的根、葉、花和果實發育過程中起重要調控作用。

由圖6可知，花后15周，油棕果實完成細胞分裂和膨脹，進入成熟階段;花后17周，油棕果皮開始轉色;花后21周，油棕果實進入內含物的快速積累期;花后23周，油棕果實進入完熟期，內含物積累達到峰值。對這4個時期的EgPYLs基因進行表達分析，結果（圖7）顯示，EgPYL1、EgPYL2、EgPYL5和EgPYL11基因在果肉成熟前期（花后15、17和21周）的表達量顯著低于果實成熟后期（花后23周），在油棕果肉成熟過程中，EgPYL4基因的表達量呈先增加后降低的表達趨勢，在花后21周達到峰值;EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9基因的表達量逐漸增高，在花后23周達到峰值，表明EgPYLs基因在油棕果肉成熟過程中發揮重要調控作用。

由圖8可知，外源ABA處理下，有11個EgPYLs基因均被誘導表達，其中EgPYL4、EgPYL5、EgPYL7、EgPYL9、EgPYL10和EgPYL12基因表達量逐漸升高，在處理1.0 h達峰值，然后逐漸降低趨于平緩，表明這11個EgPYLs基因參與外源ABA的響應。

3 討論

隨著測序技術的快速發展，植物的全基因組測序相繼完成，為植物基因的挖掘和功能鑒定打下基礎。油棕已于2013年完成全基因組測序，基因組大小為1.53 GB，共預測出34802個基因（Singh et al.，2013）。本研究利用序列比對在油棕基因組中鑒定出12個與擬南芥和水稻PYL家族蛋白氨基酸序列高度相似的序列，且均含有PYL家族蛋白特有的PYR/PYL/RCAR保守結構域，表明其為油棕PYL家族蛋白，采用生物信息學方法對其氨基酸數目、分子量和等電點等基本理化特征進行分析，結果發現其與水稻PLY蛋白（Yadav et al.，2020）的研究結果相似，如油棕PLY蛋白與水稻PLY蛋白的氨基酸序列較相似，且氨基酸數目均為200個左右，等電點在酸堿范圍均有分布，分子量均為20 kD左右，表明油棕PYL蛋白可能具有與水稻PYL蛋白相似的功能。此外，本研究基因共線分析結果顯示，EgPYL1和EgPYL6共線性，EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11共線性，推測這些共線性基因是由基因復制產生。基因復制事件能導致植物基因組中形成大量的重復基因，重復基因的存在可促進基因新功能的進化，增強植物對環境變化的適應性（Panchy et al.，2016）。而ABA是植物應對逆境脅迫最重要的激素（Verma et al.，2016），故推測PYL家族基因復制可能是油棕作為一個古老物種適應環境變化的一種進化機制。

ABA參與植物各種生理活動，包括促進種子休眠、氣孔關閉、器官脫落和果實成熟、參與響應外界生物和非生物脅迫（Nakashima and Yamaguchi-Shinozaki，2013;Leng et al.，2014;García-Andrade et al.，2020）。PYL受體是ABA信號傳導路徑中的一個核心組分，其基因表達強弱直接影響到ABA的作用。本研究發現，EgPYLs基因在油棕的根、莖尖、葉、花和果實中均有表達（圖6），表明EgPYLs基因在油棕生長發育中發揮重要的信號傳導作用。ABA作為調控植物果實成熟的重要激素，在番茄和柑橘果實成熟過程中大量積累（Sun et al.，2011;Romero et al.，2012），且外源ABA處理也可促進葡萄、草莓和柿子等植物果實成熟（Rodrigo et al.，2006;Jia et al.，2011，2013），表明PYL在ABA調控果實成熟中發揮關鍵作用。Kai等（2019）研究發現，超量表達SlPYL9基因促進果實成熟，抑制SlPYL9基因表達則延遲果實成熟。Teh等（2014）對油棕果實發育過程中的ABA含量進行測定，結果發現ABA在油棕果實成熟期迅速積累。本研究也發現，大多數EgPYLs基因的表達量隨油棕果實成熟度的增加而逐漸增加，在花后23周達到峰值，表明EgPYLs在內源ABA調控果肉成熟的過程中發揮重要的信號傳遞作用。此外，本研究用外源ABA處理油棕幼苗，結果發現11個EgPLYs基因的表達受外源ABA處理的誘導，表明EgPYLs基因可能參與油棕對逆境脅迫的響應。進一步證實油棕PYL家族基因不僅參與植物內源ABA的信號傳導，還參與植物對外源ABA的響應。

本研究對EgPLYs基因啟動子順式作用元件進行預測分析，結果顯示，除了EgPYL5基因以外，11個EgPYLs的啟動子區域含有大量的ABA響應元件，進一步說明EgPLYs基因參與油棕對逆境脅迫的響應。水稻OsPYLs基因啟動子上也發現大量ABA響應元件（約占32%）（Yadav et al.，2020）。這進一步解釋了EgPYLs基因受ABA誘導表達上調的原因。由于油棕遺傳轉化技術的限制，未對其進行功能驗證，今后可通過誘導或抑制EgPYLs基因表達，進一步研究其在油棕果實發育和ABA響應中的調控機制。

4 結論

大多數PYL基因家族成員參與油棕對逆境脅迫的響應，且部分成員（如EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9）在油棕果實發育中發揮重要的調控作用。

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（責任編輯 陳 燕）