水牛Tle6基因表達模式分析及其多克隆抗體制備

陳東榮 黃星晨 張俊俊 楊維菡 張明 付強

摘要：【目的】明確水牛Tle6基因表達組織特異性及其在卵母細胞和早期胚胎中的表達模式，并通過構建原核表達載體誘導表達融合蛋白及免疫小鼠制備TLE6多克隆抗體，為進一步揭示Tle6基因在水牛生殖發育中的作用機制提供理論依據?！痉椒ā坎捎肦T-PCR擴增水牛Tle6基因編碼區（CDS）序列，經生物信息學分析后，分別以半定量PCR和實時熒光定量PCR檢測分析水牛Tle6基因表達組織特異性及其在卵母細胞和早期胚胎中的表達模式。構建重組原核表達載體，以IPTG誘導表達的融合蛋白免疫小鼠制備TLE6多克隆抗體，再利用TLE6多克隆抗體檢驗TLE6蛋白在水牛不同組織及卵母細胞和早期胚胎中的表達情況?！窘Y果】水牛Tle6基因CDS序列全長1731 bp，編碼576個氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為64.09 kD，理論等電點（pI）為5.69，屬于親水性蛋白。Tle6基因僅在水牛的卵母細胞中特異性表達。重組原核表達載體pET-32a-Tle6轉化BL21（DE3）感受態細胞，經IPTG誘導6 h，融合蛋白TLE6的表達量最高，且以可溶性蛋白和包涵體2種形式進行表達;以純化的融合蛋白TLE6免疫小鼠成功制備獲得TLE6多克隆抗體，其抗體效價為1∶64000，能與融合蛋白TLE6及水牛卵母細胞發生特異性反應，即具有很強的特異性。【結論】Tle6基因僅在水牛卵母細胞中特異性表達，而在其他組織中未見表達。不同于其他MEGs的表達模式，Tle6基因在水牛卵母細胞及胚胎早期發育過程中呈特異性持續表達，可能在水牛卵母細胞成熟及附植前的胚胎發育過程中發揮重要作用。

關鍵詞： 水牛;Tle6基因;卵母細胞;胚胎;多克隆抗體;母源效應基因

Abstract：【Objective】Characterization of the Tle6 gene expression profile and its expression in different tissues， oocytes and preimplantation embryos in buffalo were studied. TLE6 polyclonal antibody was prepared by constructing a prokaryotic expression vector with induced fusion protein expression and immuned mice. This study laid the foundation for studying the function and regulation mechanism of Tle6 gene in buffalo reproduction development. 【Methods】The sequence of Tle6 gene coding region（CDS） of buffalo was amplified by RT-PCR. After bioinformatics analysis， a prokaryo-tic expression vector was constructed. The mouse were immunized by IPTG induced TLE6 recombinant protein for preparing the polyclonal antibody. The expression profiles of TLE6 protein in different tissues， oocytes and preimplantation embryos of buffalo was examined using TLE6 polyclonal antibody. 【Result】The CDS sequence of buffalo Tle6 gene consisted of 1731 bp， encoding 576 amino acids with the molecular weight of 64.09 kD and isoelectric point（pI） of 5.69. The TLE6 protein belonged to a hydrophilic protein. The Tle6 gene was specificly expressed in oocytes of buffalo. The recombinant pET-32a-Tle6 prokaryotic expression vector was transfer to BL21（DE3） competent cell. TLE6 protein had highest expression by 6 h IPTG induced. TLE6 protein was expressed in two forms：soluble protein and inclusion body. The TLE6 polyclonal antibody was prepared successfully by purified fusion protein TLE6 immunity mouse. The antibody titer was 1∶64000. It had specific reactions with the fusion protein TLE6 and buffalo oocytes， with strong specificity. 【Conclusion】The Tle6 gene is specifically expressed only in buffalo oocytes and is not expressed in other tissues. Different from other MEGs expression pattern， the buffalo Tle6 gene continuously expresses in oocytes and preimplantation embyros， indica-ting that may be function in oocyte maturation and preimplantation embryo development in buffalo.

Key words： buffalo; Tle6 gene; oocyte; embryo; polyclonal antibody; maternal effect genes

0 引言

【研究意義】Tle6（Transducin like enhancer 6）基因是在哺乳動物中新發現的母源效應基因（Maternal effect genes，MEGs），其編碼蛋白TLE6稱為轉錄素樣增強子6，與Floped、Mater和Filia基因的編碼蛋白在小鼠卵母細胞及早期胚胎中組成母源效應復合體（Subcortical maternal complex，SCMC）（Li et al.，2008）。SCMC是一種在哺乳動物卵母細胞及早期胚胎中特異表達的多蛋白復合物，其成分均由MEGs編碼（Li et al.，2008），可能是哺乳動物母源調控向合子調控轉變的關鍵樞紐，對早期胚胎發育具有調控作用（王夢月和周紅林，2012;Bebbere et al.，2016;王曉晴等，2018）。因此，深入研究水牛Tle6基因的生物學功能對揭示其在水牛卵母細胞成熟及胚胎發育中的作用機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Tle6基因屬于Groucho/TLE轉錄共抑制基因家族成員（Jennings and Ish-Horowicz，2008），該家族包含6個主要成員基因（Tle1～Tle6）。Tle1～Tle4基因是全長基因，而Tle5和Tle6基因是可抑制Tle1～Tle4基因功能的短型基因（Feng et al.，2020）。早期研究發現，Tle6基因可調節小鼠和綿羊的早期胚胎發育及細胞分裂（Bebbere et al.，2014）;在敲除Tle6基因的雌性小鼠中，其早期胚胎停滯在2-細胞階段，雌性小鼠繁殖能力完全喪失，進一步證實Tle6基因是胚胎發育過程中2-細胞期所必需的MEGs。TLE6是在小鼠卵母細胞及早期胚胎中形成SCMC的必需蛋白，具有調節肌動蛋白細胞骨架而控制受精卵對稱分裂的作用（Yu et al.，2014）。TLE6和SCMC共定位于卵母細胞及早期胚胎皮質下（Zhu et al.，2015）;TLE6還是一種環磷酸腺cAMP依賴性蛋白激酶A底物，在減數分裂恢復后被磷酸化（Duncan et al.，2014）。TLE6磷酸化由蛋白激酶A調控（Duncan et al.，2014;王曉晴等，2018），但具體的生理學意義有待進一步探究。Alazami等（2015）、Lin等（2020）研究表明，Tle6基因突變會導致卵裂期胚胎發育停滯，究其原因是由于TLE6與蛋白激酶A的相關位點不能被磷酸化。Wang等（2018）、Mohebi和Ghafouri-Fard（2019）在反復流產婦女的卵母細胞中發現Tle6基因突變，其表型與敲除Tle6基因小鼠的表型相似。Bebbere等（2020）研究表明，Tle6基因在綿羊青年及成年期的卵母細胞發育過程中轉錄活躍，且綿羊年齡與卵母細胞mRNA豐度呈負相關。Feng等（2020）研究發現敲除Tle6基因后小鼠精原細胞增殖緩慢，即Tle6基因可調控精原細胞的增殖及其細胞周期?？梢?，Tle6基因在動物生殖發育中起關鍵作用，且在細胞及胚胎發育過程中發揮重要的調控功能?！颈狙芯壳腥朦c】目前，針對Tle6基因的研究主要集中在人類和小鼠上，而有關Tle6基因對水牛卵母細胞及早期胚胎發育影響的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】克隆水牛Tle6基因編碼區（CDS）序列，采用RT-PCR和實時熒光定量PCR分別檢測分析Tle6基因表達的組織特異性及其在卵母細胞和早期胚胎中的表達模式，并通過構建原核表達載體誘導表達融合蛋白及免疫小鼠而獲得TLE6多克隆抗體，以期為進一步揭示Tle6基因在水牛生殖發育中的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

水牛卵巢等組織取自南寧市肉聯廠屠宰分廠;大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司;高保真酶及膠回收和質粒提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;RNA微量提取試劑盒購自QIAGEN公司;cDNA反轉錄試劑盒、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶及限制性內切酶購自TaKaRa公司;HRP標記馬抗小鼠IgG和FITG驢抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1. 2 引物設計與合成

從NCBI下載水牛Tle6基因（XM_025293142.1），采用SnapGene設計擴增引物（表1）。所有引物均委托深圳華大基因科技有限公司合成。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

通過RNA微量提取試劑盒提取水牛卵母細胞總RNA，采用TRIzol法提取水牛大腦、心臟、肝臟及腎臟等組織總RNA，檢測總RNA的濃度和純度后，以cDNA反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。

1. 4 PCR擴增

PCR反應體系25.0 μL：cDNA模板2.0 μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，RNase-free H2O 8.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進行34個循環;72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，確定擴增目的片段正確后，向PCR擴增產物中加入10.0 μL 2×Rapid Taq Master Mix，72 ℃作用20 min，即加poly（A）尾。通過膠回收試劑盒回收目的片段，連接至pMD18-T載體上，再轉化DH5α感受態細胞，并平鋪于含氨芐青霉素的LB培養基上。37 ℃培養12 h后挑選單一菌落進行PCR鑒定，陽性菌落送至深圳華大基因科技有限公司測序。

1. 5 Tle6基因生物信息學分析

采用SeqMan將測序結果拼接成完整的Tle6基因CDS序列，通過MegAlign進行同源比對分析，基于Tle6氨基酸序列相似性以MEGA 5.0構建系統發育進化樹，并利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale及SWISS-MODEL等在線軟件進行生物信息學分析。

1. 6 半定量PCR檢測分析

采集水牛的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、脊髓、舌頭、喉嚨、胃、肌肉、脂肪、睪丸、子宮和卵巢等組織樣品及卵母細胞，提取總RNA反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板、GAPDH為內參基因，進行半定量PCR檢測分析，具體PCR反應體系及擴增程序同1.4，PCR擴增產物以1.0%瓊脂糖膠電泳進行檢測。

1. 7 原核表達載體構建

通過RNA微量提取試劑盒提取水牛卵母細胞總RNA，再反轉錄合成cDNA。參考Tle6基因抗原表位及免疫原性，采用SnapGene設計含限制性內切酶EcoR I和Hind III位點引物（5'-CGGAATTCGGGA TCCAGGAGCATCTCAAGCA-3'和5'-CCCAAGCTT GGACGTCTTCGAAGTCTAGATCCTG-3'）（劃線部分為酶切位點），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將酶切獲得的目的片段連接至pMD18-T載體上，構建重組質粒pMD18-T-Tle6，然后雙酶切重組質粒pMD18-T-Tle6和原核表達載體pET-32a（+），按3∶1的比例在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接6～8 h，接種至LB培養基上，挑選陽性克隆提取質粒并進行雙酶切鑒定。

1. 8 融合蛋白表達及純化

以測序正確的重組原核表達載體pET-32a-Tle6轉化BL21（DE3）感受態細胞，搖床培養至菌液OD600 nm達0.6左右時加入最終濃度0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃下誘導6 h，加入溶解酶，在液氮中反復凍融裂解菌體，12000 r/min離心2 min，分別收集上清液和包涵體沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。采用Ni-NTA親和層析柱純化可溶性融合蛋白，并以His標簽進行鑒定。

1. 9 多克隆抗體制備與鑒定

將純化后的融合蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混合，勻漿乳化，于小鼠背部皮下多點注射1 mL;第2次免疫及以后的加強免疫均采用弗氏不完全佐劑與融合蛋白等體積混合乳化。共免疫4次，最后1次免疫后間隔7 d采集小鼠血清樣品，-80 ℃保存。使用Western blotting檢驗TLE6多克隆抗體效價，同時以TLE6多克隆抗體為一抗檢驗TLE6蛋白在水牛卵母細胞、顆粒細胞及腦、心臟、腎臟和肌肉等組織中的特異性表達情況。收集300枚GV期的水牛卵母細胞及一定量的顆粒細胞，通過液氮反復凍融提取蛋白;腦、心臟、腎臟和肌肉等組織通過液氮研磨，加入800 μL含1%苯甲基磺酰氟（PMSF）的細胞裂解液RIPA提取蛋白。經SDS-PAGE電泳后置于半干轉機上轉膜90 min，以5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，加入制備的TLE6多克隆抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗滌4次，每次5 min;加入HRP標記馬抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST洗滌4次，每次5 min;堿性磷酸酯酶顯色后進行成像分析。

1. 10 卵母細胞及早期胚胎免疫熒光染色

將收集的水牛卵母細胞和早期胚胎分別用含0.1%聚乙烯醇（PVA）的DPBS漂洗3次，4%多聚甲醛溶液固定30 min后以含0.1% PVA的DPBS漂洗3次;轉移至1% Triton X-100室溫透膜8 h，再用含0.1% PVA的DPBS漂洗3次;室溫下用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封閉2 h，將水牛卵母細胞和早期胚胎轉移至1∶400的抗體血清稀釋液（一抗）中，4 ℃孵育過夜;用含0.1% Tween-20和0.01% Triton X-100的PBS漂洗3次，每次漂洗時間不少于5 min;然后將水牛卵母細胞和早期胚胎轉移至以PBS（含1% BSA）稀釋的FITC驢抗小鼠IgG中，室溫避光孵育1 h，同樣方法漂洗5次，每次5 min;最后滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察及拍照。

2 結果與分析

2. 1 水牛Tle6基因克隆及測序分析結果

PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的條帶（圖1）與預期結果相符，采用SeqMan將3段測序結果拼接成完整的CDS序列，得到水牛Tle6基因CDS序列全長1731 bp，編碼576個氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量為64.09 kD。

2. 2 水牛Tle6基因系統發育進化樹分析結果

從NCBI上搜索并下載綿羊（XM_027970670.1）、山羊（XM_018050789.1）、牛（XM_010807024.3）、野豬（XM_021084149.1）、大鼠（XM_032909218.1）、小鼠（NM_053254.2）、獼猴（XM_028839646.1）、人類（XM_005259645.2）和倭黑猩猩（XM_008972692.1）等物種的Tle6核苷酸序列，通過MegAlign進行同源比對分析并構建系統發育進化樹。結果（圖2）顯示，水牛Tle6核苷酸序列與牛、山羊、綿羊和野豬的Tle6核苷酸序列相似性分別為97.5%、95.8%、95.6%和81.5%。

2. 3 水牛TLE6蛋白生物信息學分析結果

水牛TLE6蛋白分子量為64.09 kD，理論等電點（pI）為5.69，分子式為C2824H4365N801O862S24。ExPasy ProtScale預測結果（圖3）顯示，水牛TLE6蛋白親水性平均系數為-0.447，屬于親水性蛋白。通過PFAM數據庫預測水牛TLE6蛋白功能結構域，結果（圖4）發現該蛋白是由2種結構域組成，較前端是復雜程度低的簡單序列，后端是重復的WD40結構域，屬于轉錄輔阻遏蛋白家族成員。通過DNASTAR對水牛TLE6蛋白二級結構進行預測，結果（圖5）發現其二級結構包含24個α-螺旋、46個β-折疊、43個β-轉角及43個無規則卷曲。SWISS-MODEL預測結果（圖6）表明，水牛TLE6蛋白以α-螺旋和β-折疊結構為主。

2. 4 Tle6基因在水牛不同組織中的表達情況

由圖7可知，Tle6基因僅在水牛的卵母細胞中表達，在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、脊髓、舌頭、喉嚨、胃、肌肉、脂z肪、睪丸、子宮及卵巢等組織中均不表達。

2. 5 水牛Tle6基因原核表達載體構建結果

采用含酶切位點的引物對水牛Tle6基因進行PCR擴增，結果獲得198 bp目的片段，連接至經Hind III和EcoR I雙酶切后的原核表達載體pET-32a（+）上，即獲得重組原核表達載體pET-32a-Tle6，然后轉化BL21（DE3）感受態細胞并接種至LB培養基上，挑選陽性克隆，提取質粒進行雙酶切處理，再以含酶切位點的引物進行PCR鑒定，結果在200 bp附近獲得1條明亮清晰的單一條帶（圖8），與預期結果相符，說明水牛Tle6基因已插入原核表達載體pET-32a（+）。送至深圳華大基因科技有限公司的測序結果也表明，水牛Tle6基因已正確插入原核表達載體pET-32a（+），即成功構建獲得重組原核表達載體pET-32a-Tle6。

2. 6 融合蛋白TLE6誘導表達及純化結果

重組原核表達載體pET-32a-Tle6轉化BL21（DE3）感受態細胞，經IPTG誘導6 h，融合蛋白TLE6的表達量達最高值，以可溶性蛋白和包涵體2種形式進行表達。由于可溶性蛋白的純化過程較包涵體的簡便，因此后續試驗選擇可溶性蛋白（上清液）為研究對象。融合蛋白TLE6經Ni-NTA親和層析柱純化，其SDS-PAGE電泳結果顯示約在25.00 kD處出現預期的目的蛋白條帶（圖9-A），且純化后融合蛋白TLE6的雜帶較未純化融合蛋白明顯減少，即蛋白純化效果良好，可用于免疫小鼠制備多克隆抗體。以His標簽檢驗復性后的可溶性融合蛋白TLE6，Western blotting檢驗結果顯示得到1條約25.00 kD的特異性目的條帶（圖9-B），進一步說明融合蛋白TLE6純化效果良好。

2. 7 TLE6多克隆抗體效價

以純化的融合蛋白TLE6免疫小鼠制備TLE6多克隆抗體（血清），按梯度等比（1∶1000～1∶64000）稀釋后，與融合蛋白TLE6進行Western blotting檢測分析，結果（圖10）顯示在25.00 kD附近能檢測到預期的目的條帶，表明已成功制備獲得TLE6多克隆抗體，其抗體效價為1∶64000。

2. 8 TLE6蛋白在水牛不同組織中的表達情況

以TLE6多克隆抗體為一抗，按1∶8000稀釋后用于檢測TLE6蛋白在水牛不同組織及卵母細胞和顆粒細胞中的表達情況。結果表明，TLE6蛋白僅在水牛卵母細胞中表達（圖11），在其他細胞和組織中均無表達分布（圖12），其目的蛋白大小為64.00 kD。在水牛卵母細胞樣品中，目的蛋白條帶單一且無雜帶，表明制備獲得的TLE6多克隆抗體具有很強特異性。

2. 9 TLE6蛋白在水牛卵母細胞及早期胚胎中的表達情況

為進一步確定TLE6蛋白在水牛卵母細胞中的表達情況，分別收集不同發育期的水牛卵母細胞及早期胚胎進行免疫熒光染色。免疫熒光染色結果（圖13）顯示，在不同發育期的水牛卵母細胞及早期胚胎中均能發現TLE6蛋白熒光信號，表明TLE6蛋白在水牛卵母細胞成熟過程持續表達，但呈逐漸降低的變化趨勢，故推測TLE6在水牛卵母細胞的發育過程中扮演重要角色。

3 討論

Tle6基因是Groucho/TLE轉錄共抑制基因家族成員之一，在小鼠胚胎和成年鼠的組織中廣泛表達（Dang et al.，2001）。Tle6基因于2005年首次在發育中的人類大腦皮層神經祖細胞中被鑒定（Li et al.，2008）。Bebbere等（2014）研究發現，TLE6蛋白僅在綿羊卵母細胞及胚胎中表達，在其他胚泡、肺臟、肌肉、腎臟、小腦、睪丸、卵巢、脾臟、肝臟及心臟等組織中均未檢測到相應的轉錄本;而Zhu等（2015）研究發現人類的TLE6轉錄本在卵巢和腎臟中高表達。TLE6能與MATER、FLOPED和FILIA等已證實的母源性蛋白結合形成SCMC。TLE6與SCMC的其他成員一樣定位于小鼠卵母細胞及早期胚胎的皮質下，在Tle6基因缺失小鼠中無法形成SCMC，導致紡錘體偏移，最終產生大量不均等的2-細胞胚胎，隨后胚胎發育停滯（Yu et al.，2014），即Tle6基因是小鼠的MEGs。至今，Tle6基因功能僅在小鼠中被證實，針對大型家畜的Tle6基因功能尚無研究報道，其在水牛卵母細胞及胚胎早期發育過程中是否作為母源性基因有待進一步探究。

本研究結果表明，Tle6基因僅在水牛卵母細胞中表達，在其他組織均無表達，揭示Tle6基因在水牛卵母細胞的生長發育過程中扮演重要角色，與已報道的小鼠Tle6基因（Yu et al.，2014）一致。水牛Tle6核苷酸序列與牛、山羊、綿羊和野豬的Tle6核苷酸序列相似性分別為97.5%、95.8%、95.6%和81.5%，說明Tle6基因具有較高的保守性。小鼠TLE6蛋白包含581個氨基酸殘基，分子量為65.00 kD（Feng et al.，2020）;而水牛TLE6蛋白由576個氨基酸殘基組成，其分子量為64.09 kD，屬于親水性蛋白，說明Tle6基因在不同物種間的轉錄本表達也有所不同。TLE6蛋白功能結構域預測結果顯示，其具有5個色氨酸—天冬氨酸重復單元（WD）（Li and Roberts，2001），但缺少與Groucho/TLE寡聚化有關的2個與特定轉錄因子結合的氨基酸，能介導并參與大多數轉錄因子（羧基末端的WD40重復結構域）的相互作用（Marcal et al.，2005）。

在小鼠中，Tle6基因轉錄本在卵母細胞的發生過程中積累，于生發泡破裂期（GV）達高峰，從減數分裂成熟和排卵后開始降解，在胚胎發生過程中完全消失;但TLE6蛋白在植入前的胚胎中一直持續表達至囊胚階段（Li et al.，2008）。本研究的實時熒光定量PCR檢測結果顯示，Tle6基因水牛卵母細胞發育至桑椹胚前均有表達，且以4-細胞期的相對表達量最高，隨后開始呈下降趨勢，在桑椹胚階段其相對表達量急劇下降，至囊胚期未能檢測到Tle6基因表達，揭示Tle6基因在水牛卵母細胞生成及胚胎早期發育過程中發揮一定功能作用，但不同于小鼠Tle6基因的表達模式，故推測水牛Tle6基因并非MEGs。

本研究選擇常用的大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞為表達菌株，采用含His標簽的pET-32a（+）載體為原核表達載體，His標簽可鑒定融合蛋白是否正確表達（陳東榮等，2020）。融合蛋白在大腸桿菌中的表達形式主要有2種：（1）胞外分泌可溶性蛋白，易純化，保留融合蛋白的天然結構，簡單透析除去鹽分便可于免疫試驗;（2）胞內表達的無活性包涵體，需經復雜的變性、復性程序才能得到有活性的融合蛋白。IPTG濃度是影響融合蛋白TLE6表達的主要因素之一，本研究的預試驗通過設0.05～1.00 mmol/L共11個IPTG濃度梯度誘導融合蛋白表達，結果發現以0.5 mmol/L IPTG的誘導效果最佳。此外，本研究采用30 ℃作為誘導溫度，可降低融合蛋白誘導合成的速率，而有利于提高融合蛋白的可溶性表達。以IPTG誘導表達的純化融合蛋白TLE6免疫小鼠，成功制備獲得TLE6多克隆抗體，其抗體效價為1∶64000，能與融合蛋白TLE6及水牛卵母細胞發生特異性反應，即具有很強的特異性，為深入研究TLE6蛋白在水牛卵母細胞及早期胚胎中的功能作用提供了技術支撐。

4 結論

Tle6基因僅在水牛卵母細胞中特異性表達，而在其他組織中未見表達。不同于其他MEGs的表達模式，Tle6基因在水牛卵母細胞及胚胎的早期發育過程呈特異性持續表達，可能在水牛卵母細胞成熟及附植前胚胎發育過程中發揮重要作用。

參考文獻：

陳東榮，肖凱，段林偉，張明. 2020. 水牛NLRP5基因原核表達載體構建及多克隆抗體制備[J]. 黑龍江動物繁殖，28（4）：1-6. doi：10.19848/j.cnki.ISSN1005-2739.2020.05. 1003. [Chen D R，Xiao K，Duan L W，Zhang M. 2020. Construction prokaryotic expression vector and preparation of polyclonal antibody of buffalo NLRP5 gene[J]. Heilongjiang Journal of Animal Reproduction，28（4）：1-6.]

王夢月，周紅林. 2012. 母源性效應因子復合體研究進展[J]. 昆明醫學院學報，（1B）：35-37. [Wang M Y，Zhou H L. 2012. Research progress of subcortial maternal complex[J]. Journal of Kunming Medical University，（1B）：35-37.]

王曉晴，秦丹丹，盧緒坤，李磊. 2018. 卵母細胞和早期胚胎特異的皮質下母源效應復合體[J]. 中國科學：生命科學，48（6）：609-617. doi：10.1360/N052018-00036. [Wang X Q，Qin D D，Lu X K，Li L. 2018. The oocyte-early embryo-specific subcortical maternal complex in mammals[J]. Scientia Sinica（Vitae），48（6）：609-617.]

Alazami A M，Awad S M，Coskun S，Al-hassan S，Hijazi H，Abdulwahab F M，Poizat C，Alkuraya F S. 2015. TLE6 mutation causes the earliest known human embryonic lethality[J]. Genome Biology，16：240. doi：10.1186/s13059- 015-0792-0.

Bebbere D，Abazari-Kia A，Nieddu S，Murgia M B，Albertini D F，Ledda S. 2020. Subcortical maternal complex （SCMC） expression during folliculogenesis is affected by oocyte donor age in sheep[J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics，37（9）：2259-2271. doi：10.1007/s10815- 020-01871-x.

Bebbere D，Ariu F，Bogliolo L，Masala L，Murrone O，Fattorin M，Ledda S. 2014. Expression of maternally derived KHDC3，NLRP5，OOEP and TLE6 is associated with oocyte developmental competence in the ovine species[J]. BMC Developmental Biology，14：40. doi：10.1186/s12861-014-0040-y.

Bebbere D，Masala L，Albertini D F，Ledda S. 2016. The subcortical maternal complex：Multiple functions for one biological structure？[J] Journal of Assisted Reproduction and Genetics，33（11）：1431-1438. doi：10.1007/s10815-016-0788-z.

Dang J，Inukai T，Kurosawa H，Goi K，Inaba T，Lenny N T，Downing J R，Stifani S，Look A T. 2001. The E2A-HLF oncoprotein activates Groucho-related genes and suppres-ses Runx1[J]. Molecular and Cellular Biology，21（17）：5935-5945. doi：10.1128/MCB.21.17.5935-5945.2001.

Duncan F E，Padilla-banks E，Bernhardt M L，Ord T S，Jefferson W N，Moss S B，Williams C J. 2014. Transducin-like enhancer of split-6（TLE6） is a substrate of protein kinase A activity during mouse oocyte maturation[J]. Biology of Reproduction，90（3）：63. doi：10.1095/biolreprod.113.112 565.

Feng M Y，Bai Y S，Chen Y，Wang K. 2020. Knockout of the transducin-like enhancer of split 6 gene affects the proli-feration and cell cycle process of mouse spermatogonia[J]. International Journal of Molecular Sciences，21（16）：5827. doi：10.3390/ijms21165827.

Jennings B H，Ish-Horowicz D. 2008. The Groucho/TLE/Grg family of transcriptional co-repressors[J]. Genome Bio-logy，9（1）：205. doi：10.1186/gb-2008-9-1-205.

Li D，Roberts R. 2001. WD-repeat proteins：Structure characteristics，biological function，and their involvement in human diseases[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，58（14）：2085-2097. doi：10.1007/pl00000838.

Li L，Baibakov B，Dean J. 2008. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis[J]. Developmental Cell，15（3）：416-425. doi：10.1016/j.devcel.2008.07.010.

Lin J，Xu H，Chen B B，Wang W J，Wang L，Sun X X，Sang Q. 2020. Expanding the genetic and phenotypic spectrum of female infertility caused by TLE6 mutations[J]. Journal of Assisted Reproduction and Genetics，37（2）：437-442. doi：10.1007/s10815-019-01653-0.

Marcal N，Patel H，Dong Z F，Belanger-jasmin S，Hoffman B，Helgason C D，Dang J J，Stifani S. 2005. Antagonistic effects of Grg6 and Groucho/TLE on the transcription repression activity of brain factor 1/FoxG1 and cortical neuron di-fferentiation[J]. Molecular and Cellular Biology，25（24）：10916-10929. doi：10.1128/MCB.25.24.10916-10929. 2005.

Mohebi M，Ghafouri-Fard S. 2019. Embryo developmental arrest：Review of genetic factors and pathways[J]. Gene Reports，17（2）：100479. doi：10.1016/j.genrep.2019.100479.

Wang X Q，Song D，Mykytenko D，Kuang Y P，Lü Q F，Li B，Chen B B，Mao X Y，Xu Y，Zukin V，Mazur P，Mu J，Yan Z，Zhou Z，Li Q L，Liu S Y，Jin L，He L，Sang Q，Sun Z G，Dong X，Wang L. 2018. Novel mutations in genes encoding subcortical maternal complex proteins may cause human embryonic developmental arrest[J]. Reproductive Biomedicine Online，36（6）：698-704. doi：10.1016/ j.rbmo.2018.03.009.

Yu X J，Yi Z H，Gao Z，Qin D D，Zhai Y H，Chen X，Ouyang Y C，Wang Z B，Zheng P，Zhu M S，Wang H B，Sun Q Y，Dean J，Li L. 2014. The subcortical maternal complex controls symmetric division of mouse zygotes by regula-ting F-actin dynamics[J]. Nature Communications，5：4887. doi：10.1038/ncomms5887.

Zhu K，Yan L Y，Zhang X X，Lu X K，Wang T R，Yan J，Liu X Q，Qiao J，Li L. 2015. Identification of a human subcortical maternal complex[J]. Molecular Human Reproduction，21（4）：320-329. doi：10.1093/molehr/gau116.

（責任編輯 蘭宗寶）