貴州地區981例人巨細胞病毒熒光定量PCR檢測結果分析*

許永杰，羅振元，葉芝旭，余福勛，王樹輝

(貴州省人民醫院:1.檢驗科;2.兒科;3.中心實驗室，貴州 貴陽550002)

人巨細胞病毒(hCMV)是一種潛伏性雙鏈DNΑ病毒，屬于β皰疹病毒亞科[1]。hCMV感染在臨床上較為普遍，是引起圍生兒病毒性感染的常見病因。hCMV侵入人體后可在宿主體內長期持續存在，免疫功能正常個體多表現為無癥狀感染，但病理性和生理性免疫低下人群，尤其免疫系統發育不成熟的胎兒、嬰幼兒，其可侵襲多個器官、系統，造成先天性或圍生期疾病等，且年齡越小易感性越高[2-3]。實時熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)是臨床實驗室診斷hCMV感染的快速檢測技術。本文回顧性分析本院2021年2-4月送檢的血液和尿液樣本中hCMV-DNA的FQ-PCR檢測結果，共981例，為臨床合理診斷hCMV感染提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年2-4月進行hCMV-DNA檢測項目的血液和尿液樣本作為研究對象，回顧性分析2種樣本hCMV-DNA的FQ-PCR檢測數據，并采集有臨床診療價值的陽性標本信息，但不涉及患者個人隱私信息。

1.2方法

1.2.1試劑與儀器

1.2.1.1試劑 hCMV核酸檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)，人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)。

1.2.1.2儀器 Genlier96e型FQ-PCR儀(西安天隆科技有限公司)。

1.2.2方法

1.2.2.1尿液于12 000 r/min條件下離心10 min后吸去上清液，在尿沉渣中加入hCMV-DNA檢測FQ-PCR試劑盒中的DNA提取液50 μL并混勻后在100 ℃金屬浴中放置10 min，最后提取混合液于12 000 r/min條件下離心10 min，其上清液備用于后續FQ-PCR檢測。

1.2.2.2乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血緩慢加入到單個核細胞提取液試管中并于3 000 r/min條件下離心15 min，之后吸取淋巴細胞白膜層并用生理鹽水洗滌1次，洗滌后細胞沉淀同于尿沉渣提取條件下提取hCMV-DNA備用后續FQ-PCR檢測。

1.2.2.3實驗步驟 從尿液和血液標本的hCMV-DNA提取液中吸取上清液2 μL加入至43 μL FQ-PCR體系。在Genlier96e型FQ-PCR儀上運行如下程序：第1階段：預變性(1個周期)，93 ℃ 2 min；第2階段：兩步法擴增(10個周期)，93 ℃ 45 s(變性)，55 ℃ 60 s(退火/延伸)；第3階段：兩步法擴增(30個周期)，93 ℃ 30 s(變性)，55 ℃ 45 s(退火/延伸)。FQ-PCR試劑盒中定量參考品稀釋至104、105、106、107copies/mL標準濃度與臨床樣本行相同操作，以建立線性方程用于臨床樣本中hCMV-DNA的定量檢測。hCMV-DNA定量值低于500 copies/mL判讀為陰性，大于或等于500 copies/mL且小于104copies/mL判讀為弱陽性，大于或等于104copies/mL判讀為陽性。

1.3統計學處理 采用 SPSS16.0 統計軟件對數據進行分析，不同類型標本hCMV感染陽性率采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1臨床檢測樣本中不同性別受檢者hCMV-DNA陽性率分析 981例hCMV-DNA檢測樣本中男性hCMV-DNA的陽性率顯著高于女性(P<0.01)。見表1。

表1 981例hCMV-DNA檢測樣本中不同性別受檢者陽性率分析

2.2不同類型臨床檢測樣本hCMV-DNA陽性率分析 981例hCMV-DNA檢測樣本中，尿液樣本的陽性檢出率顯著高于血液樣本(P<0.01)。見表2。

表2 981例hCMV-DNA檢測樣本中血液和尿液陽性率分析

2.3臨床不同類型樣本hCMV-DNA聯合檢測結果對比分析 167例陽性樣本中，尿液和血液hCMV-DNA聯合檢測呈陽性的樣本數共91例。收集該91例患者hCMV-DNA的FQ-PCR數據信息，按照定量判斷標準對2種標本類型的陽性率進行對比分析。聯合檢測91例陽性標本中，尿液標本檢測陽性88例，陰性3例，陽性率為96.70%；而血液標本陽性25例，陰性66例，陽性率為27.47%。見表3。

表3 91例聯合檢測樣本中血液和尿液hCMV-DNA檢測陽性率對比分析

2.4hCMV-DNA檢測陽性患者的年齡分布特征 收集167例陽性樣本來源患者年齡信息并進行統計分析，因嬰幼兒免疫力未發育成熟，易受hCMV感染，且隨年齡增加免疫力逐步增強，機體不易受巨細胞病毒感染，故1-12月階段按月份進行樣本量統計，發現2～4個月的嬰幼兒hCMV-DNA陽性率高于其他月齡段。1～9歲階段按年份進行樣本量統計，10歲以上按年齡段進行樣本量統計。見表4。

表4 167例hCMV-DNA陽性樣本在不同年齡組的分布情況

3 討 論

hCMV感染在我國極其廣泛，一般人群hCMV抗體陽性率為86%～96%，孕婦約為95%，嬰幼兒期為60%～80%，原發感染多發生于嬰幼兒時期，一旦感染，將持續終身[4]。在新生兒期檢出病毒DNA是原發感染的證據。目前，臨床檢測hCMV感染的主要標本來源有血液、尿液、唾液、乳汁、臍帶血等。本文針對臨床受檢者血液和尿液中981例hCMV-DNA定量檢測結果進行回顧性統計分析。從表1中可以看出，981例hCMV-DNA定量檢測結果中男性hCMV-DNA陽性率高于女性。從表2中可以看出，尿液樣本hCMV-DNA陽性率為39.22%，而血液分離單個核細胞樣本hCMV-DNA陽性率為9.22%，2種檢測方法差異有統計學意義(P<0.05)。該報道中2種標本檢測陽性率低于朱艷等[5]報道的尿液樣本陽性率為70.43%和血液分離單個核細胞樣本陽性率為49.09%，但2項結果均顯示尿樣本陽性率比血樣本陽性率高。唾液腺和腎臟是hCMV感染的最主要排毒部位，尿液中可能存在高濃度的hCMV-DNA載量，可造成尿液樣本hCMV-DNA陽性率顯著高于血液分離單個核細胞樣本。

為更準確地分析2種樣本基于Genlier96e型實時熒光定量PCR儀檢測陽性率的差異，在167例檢測陽性樣本中篩選出感染者在同一時期內2種樣本聯合檢測的樣本共91例。因hCMV具有潛伏-活化的生物學特性且hCMV-DNA載量與活動性感染呈正相關，高載量或動態監測中出現載量明顯升高提示活動性感染可能，故根據判斷標準將hCMV-DNA載量不同的91例陽性標本分為弱陽性和陽性進行2類不同樣本檢出情況分析。從表3中可以看出，尿標本hCMV-DNA弱陽性而血液樣本陰性標本占比16.48%，尿標本hCMV-DNA陽性而血液樣本陰性標本占比56.04%，2種情況合計高達72.53%；血液樣本hCMV-DNA弱陽性而尿標本陰性占比2.20%，血液hCMV-DNA陽性而尿標本陰性占比1.10%，尿樣本2種情況合計低至3.30%。基于2種樣本聯合檢測結果，尿標本檢測陽性率高達96.70%，而血液樣本陽性率低至27.47%。另外，血液樣本hCMV-DNA陽性而尿標本陰性的1例標本患者在2021年5月3日尿定量hCMV-DNA檢測中呈陽性，血尿2種類型標本陽性結果具有一致性。從FQ-PCR結果推知，當臨床感染癥狀時，血液樣本當聯合尿標本同時送檢進行hCMV-DNA檢測，以避免漏診hCMV感染。該結果可能部分由于年長兒和成人免疫正常時，hCMV感染多局限于唾液腺和腎臟，少數累及淋巴細胞。另外，由于腎臟是無癥狀hCMV感染者常見排毒部位且排毒時長可達數年之久，尿液中檢出hCMV-DNA需謹慎解釋[4]。hCMV感染高發人群主要包括母親孕期有原發感染或再發感染的新生兒，1歲以下嬰兒，接受骨髓、干細胞或實體器官移植者，接受大劑量或長期免疫抑制劑或糖皮質激素治療者等[4,6-7]。從表4中可以看出，167例陽性樣本來源患者年齡信息，12月齡以內例數最多共117例(包括1例4 d新生兒)，占總陽性數的70.06%，其中2～4個月齡比例數最多，占此月齡段患兒的56.41%；2～9歲23例，占總陽性數的13.77%，其中2～4歲幼兒例數最多，占此年齡段患兒的86.96%；20歲以上成人27例，散在分布。此結果與1歲以下嬰兒屬于高峰人群相符[4]，且顯示2～4個月齡具有占比最高的分布特點。

本研究分析主要針對Genlier96e型FQ-PCR儀定量檢測尿標本和血液分離單個核細胞樣本的hCMV-DNA的結果進行統計分析。由于hCMV感染存在多種檢測方法[8-10]，hCMV-DNA陽性結果與臨床hCMV感染診斷結果之間存在偏差。從表3中可以看出，hCMV-DNA陽性率統計時直接用尿標本和血液分離單個核細胞樣本hCMV-DNA陽性例數作為hCMV感染例數，此種方法統計的檢測陽性率雖與臨床hCMV感染實際檢測陽性率存在偏差，但可真實反映基于FQ-PCR法檢測2種不同臨床樣本在診斷hCMV感染中的分析性能。從表4中可以看出，對hCMV-DNA陽性標本來源的月齡/年齡分布進行分析，但由于感染臨床表現癥狀多樣性，未對每個年齡段對應的臨床診斷進行統計分析。hCMV-DNA陽性患者的臨床癥狀中有58例表現為支氣管肺炎，13例表現為肺炎，18例表現為肝膽系統疾病，6例表現為血小板減少，4例表現為腎臟系統疾病等，這與巨細胞感染相關的肺炎[11-12]、肝肝膽疾病[13]、血小板減少[14]和腎臟疾病[15]等臨床癥狀相符。統計發現，送檢樣本中有血液標本726例和尿液標本255例，然而尿液標本較血液分離單個核細胞樣本hCMV-DNA陽性率高，且尿液具有易采集、接受率高和檢測操作過程簡便等優勢，巨細胞感染診斷應提高尿液標本送檢率。

綜上所述，血液和尿液hCMV-DNA聯合檢測可提高hCMV感染診斷的準確性，對于血hCMV-DNA檢測結果為陰性，但結合臨床癥狀與體征hCMV感染可能性較大的患者，應及時進行尿hCMV-DNA檢測，從而實現早期診斷和早治療。