溫度和水分變化對凍土區泥炭地土壤氮循環功能基因豐度的影響

馬秀艷,蔣 磊,宋艷宇,*,孫 麗,宋長春,侯愛新,高晉麗,杜 宇

1 中國科學院東北地理與農業生態研究所,濕地生態與環境重點實驗室, 長春 130102 2 美國路易斯安那州立大學,海岸與環境學院, 美國 LA 70803

土壤微生物能夠調節陸地生物地球化學循環,是土壤中重要的物質循環推動者,同時也是生物圈與非生物圈物質與能量交換的重要樞紐[1]。它們在土壤有機質分解和元素循環中起著重要作用,土壤微生物通過微生物作用與周圍環境發生交換,以此獲得營養物質來滿足自身需要[2]。土壤微生物本身也是土壤養分庫,對土壤養分的轉化與供應起著重要作用[3]。

固氮微生物種類豐富,其體內存在具有催化功能的固氮酶,其中nifH 基因編碼固氮酶中的鐵蛋白[4],是所有固氮微生物含有的最保守的功能基因,因此nifH基因被廣泛應用于研究固氮微生物群落[5]。反硝化作用是氮循環的關鍵步驟之一,反硝化是微生物參與土壤氮循環的重要過程之一。土壤中反硝化過程主要是由異養反硝化細菌完成[6- 7]。參與反硝化過程的酶主要有硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶,它們的編碼基因分別為nar、nirK/nirS、norB和nosZ,其中亞硝酸還原酶中的nirK和nirS分別為可溶性含銅酶和細胞色素酶的編碼基因,是反硝化過程中研究最多也是最重要的功能基因[8]。

土壤微生物對溫度變化敏感,其對溫度的響應直接影響生態系統過程[9]。溫度是控制生物反應的基礎,不同生物體溫度敏感性的變化可能會影響微生物對氣候變化的響應[10]。溫度升高可以促進土壤微生物的呼吸作用,微生物消耗土壤中的氧氣使土壤呈厭氧環境進而影響反硝化作用[11]。有研究表明,溫度變化對微生物量、微生物群落及其組成有直接影響[12- 13]。對草原生態系統土壤反硝化速率及其相關微生物變化的研究發現增溫顯著增加了高寒草原土壤中的反硝化細菌的數量及土壤反硝化速率[14]。土壤水分含量是土壤氮素轉化過程中至關重要的影響因素。土壤水分含量與其他土壤理化性質共同作用可顯著改變土壤的孔隙度及孔隙分布,從而影響氧氣在土壤中的流通,進而影響微生物的活性[15- 16]。短期的溫度升高和水分增加可顯著提高土壤nifH基因豐度[17],不同水分條件下土壤中nirK和nirS基因豐度隨著水分的增加而增加[18],nirK基因對土壤水分變化的響應更靈敏[19]。因此,研究溫度和水分變化對氮循環功能基因豐度的影響對于明確未來氣候變化影響下氮循環過程具有重要意義。

大興安嶺是我國唯一的地帶性凍土分布區,也是世界上主要的泥炭分布區之一[20],在全球變暖的影響下,中國東北的永久凍土區在過去的幾十年里經歷了顯著退化[21],永凍層不再是永久凍土而是轉變成季節融化層,溫度升高使得凍土融化,導致活動層呈淹水狀態。前期研究表明溫度升高會促進凍土泥炭地N2O的釋放,但其微生物機制尚不明確。本研究以大興安嶺凍土泥炭地為研究對象,通過室內模擬培養試驗,采用實時定量PCR技術,研究土壤氮循環相關微生物對溫度和水分變化的響應。本研究旨在為全球變暖影響下永久凍土區泥炭地氮循環變化提供基礎數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究站點位于大興安嶺連續多年凍土區(東經122°86′,北緯52°94′),屬于寒溫帶季風性氣候,全年無霜85—110 d,11月—次年4月冬季積雪,凍結期大概為7個月[22]。年平均溫度為-3.9℃。年平均降雨量為350—550 mm,降水主要集中在7—8月[23]。該地區主要植物類型包括常綠灌木、落葉灌木、草本植物,其中常綠灌木的主要代表為細葉杜香(Ledumpalustre)和甸杜(Chamaedaphnecalyculata),落葉灌木的主要代表為篤斯越橘(Vacciniumuliginosum),草本植物的主要代表為羊胡子草(Eriophorumvaginatum),而地被植物的主要代表為泥炭蘚(Sphagnumpalustre)[24]。該地區的土壤類型為泥炭土。

1.2 樣品采集與培養

2018年8月,選取大興安嶺凍土區典型泥炭地,隨機選取樣地,采樣地之間的距離至少為10 m,每處用土鉆采集8個土壤深度(0—20、20—40、40—60、60—80、80—100、100—120、120—140 cm和140—150 cm),其中0—60 cm深度為活動層,60—80 cm深度為過渡層,80 cm以下深度為永凍層。人工挑出植物根系、新鮮凋落物和石塊等雜物,低溫保存運回實驗室。取一部分新鮮土壤樣品測定土壤pH值和含水量,一部分土壤樣品置于陰涼處風干后研磨,過0.25 mm篩,測定土壤樣品的初始全氮含量。用于培養的土壤樣品冷凍保存。

1.3 實驗方法

1.3.1土壤微生物功能基因豐度及溫度敏感性

土壤微生物DNA提取[25]:按照土壤Fast DNA SPIN快速提取試劑盒(MPbio,USA)說明書準確稱取0.3 g土壤樣品到Lysing Matrix E管中,加入978 μL Sodium Phosphate Buffer和122 μL MT Buffer,采用FastPrep?處理后離心14000 g×10 min,將上清液轉移到一個新的2 mL離心管中,加入250 μL PPS離心14000 g×5 min,將上清液轉移到一個新的5 mL離心管并加入1 mL Binding Matrix Suspension,用手顛倒2 min后靜置3 min,去除500 μL上清后轉移混合液到SPINTM Filter后離心14000 g×1 min,加入500 μL SEWS-M到SPINTM Filter中離心14000 g×1 min,將SPINTM Filter下面catch tube中的液體倒掉,再離心14000 g×2 min,將SPINTM Filter放到一個新的Catch Tube中室溫下風干5 min,加入100 μL DES離心14000 g×1 min使DNA轉移到Catch Tube中,-80℃冰箱保存。

提取后用0.5%低熔點瓊脂糖凝膠純化DNA提取物,用苯酚-氯仿-丁醇萃取。為了獲得更具代表性的DNA樣本對每個樣本進行3次重復處理。通過熒光定量PCR儀(7500,ABI,美國)定量測定細菌的nifH、nirK和nirS基因豐度[26]。擴增所用引物及擴增程序見表1,實時熒光定量PCR反應體系為25 μL∶12.5 μL的1×SYBR緩沖液(TaKaRa,Japan),0.4 μL引物(10 μM),0.5 μL ROXΙΙ(TaKaRa),0.875 μL 3%BSA,0.625 μL 二甲亞砜(DMSO),10 ng DNA模板。

土壤微生物溫度敏感性[30]:

式中,Abundance1代表較低溫度T1測定的微生物豐度,Abundance2代表較高溫度T2測定的微生物豐度。

1.3.2土壤理化性質測定

1.4 數據處理與分析

運用SPSS 17.0軟件,采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)和顯著性差異(Tukey)以及Pearson相關分析等方法對不同土壤深度下土壤氮循環相關微生物功能基因豐度以及無機氮含量進行差異顯著性分析,檢驗溫度和水分變化對土壤氮循環相關微生物數量的影響,所有數據在進行方差分析前均進行正態性檢驗(s-w 檢驗),且符合正態分布,并運用Excel 2007進行繪圖。

2 結果

2.1 土壤初始理化性質

不同深度土壤初始理化性質如表2所示。土壤含水量范圍為57.49%—79.03%,土壤pH值范圍為4.50—4.76,土壤總氮含量變化范圍為4.48—11.53 mg/g。土壤含水量和總氮的最大值均出現在過渡層(60—80 cm),最小值均出現在凍土層(140—150 cm)。該地區土壤偏酸性,并且土壤酸性隨土層深度的增加而減弱。

2.2 溫度升高對泥炭地土壤氮循環相關微生物的影響

2.2.1溫度升高對土壤氮循環相關微生物功能基因豐度的影響及其溫度敏感性

培養55 d后,土壤氮循環相關微生物功能基因豐度變化如圖1所示:0—20、20—40、40—60、60—80、80—100、100—120、120—140、140—150 cm土層nifH、nirK、nirS功能基因豐度分別為1.11×1010—1.08×1011、2.60×106—6.87×108、9.07×107—2.18×109基因拷貝數/g干土。0—20、20—40、60—80、80—100 cm土層中nifH基因豐度隨著溫度的升高顯著增加,140—150 cm土層中nifH的基因豐度隨著溫度的升高顯著降低,溫度升高顯著提高了0—20、20—40、40—60、60—80、80—100和140—150 cm土層nirK基因豐度。0—20、20—40、60—80 cm土層中nirS基因豐度隨著溫度的升高而顯著增加,但是100—120、120—140、140—150 cm土層中nirS基因豐度隨著溫度的升高而顯著減少(表3)。雙因素方差分析結果表明,溫度和土壤深度對nifH、nirK和nirS基因有顯著影響,并且存在交互作用(表4)。nifH、nirK、nirS功能基因豐度的溫度敏感性(Q10)平均值分別為1.51、2.53、1.22。nifH、nirK、nirS功能基因豐度的溫度敏感性分別在60—80、40—60、60—80 cm土層最高,在20—40、100—120、120—140 cm土層最低(圖1)。

圖1 溫度升高對不同深度土壤氮循環相關功能基因豐度的影響及其溫度敏感性Fig.1 Effect of temperature increasing on soil nitrogen cycle related functional gene abundance and its temperature sensitivity at different soil depths

表3 溫度對不同深度土壤氮循環相關功能基因豐度和有效氮含量影響的方差分析

2.2.2溫度升高對土壤有效氮含量的影響及其與氮循環相關微生物的相關性

表4 溫度和土壤深度及其交互作用對氮循環相關功能基因豐度和有效氮含量影響的雙因素方差分析

圖2 溫度升高對不同深度土壤含量的影響Fig.2 The effect of temperature increasing on contents at different soil depths

表5 氮循環相關功能基因與土壤氮含量相關分析

2.3 溫度和水分變化對泥炭地表層土壤氮循環相關微生物的影響

2.3.1泥炭地表層土壤氮循環相關微生物基因豐度變化

不同溫度和水分條件下表層土壤固氮和反硝化細菌數量變化如圖3所示:在5℃和15℃條件下,淹水處理使20—40 cm土壤nifH基因豐度增加了104.19%和18.28%。0—20 cm層nirS基因豐度分別降低了37.21%和74.86%,nirK基因豐度分別降低了54.78%和57.06%。20—40 cm土壤nirS基因豐度分別降低了10.88%和67.02%,nirK基因豐度分別降低了50%和29.33%。在淹水條件下,溫度升高使0—20和20—40 cm土壤中的nifH基因豐度分別增加了18.68%和11.47%,nirS基因豐度分別降低了32.26%和25.94%,而nirK基因豐度分別增加了212.17%和135.95%。水分及溫度和水分的交互作用對0—20、20—40 cm層nirS和nirK及20—40 cm的nifH基因豐度有顯著影響(表6)。

圖3 溫度和水分變化對表層土壤氮循環關鍵功能基因豐度的影響Fig.3 Effects of temperature and moisture on nitrogen cycle related functional gene abundance at topsoil

表6 溫度和水分對表層土壤氮循環功能基因豐度及氮含量影響的雙因素方差分析

2.3.2泥炭地表層土壤氮含量變化及其與氮循環相關微生物豐度的關系

圖4 溫度和水分對表層土壤氮含量的影響Fig.4 Effects of temperature and moisture on nitrogen contents at topsoil

表7 表層土壤氮循環相關功能基因豐度與土壤氮含量的相關分析

3 討論

3.1 泥炭地不同深度土壤氮循環相關微生物及有效氮含量對溫度變化的響應

3.1.1泥炭地土壤氮循環微生物對溫度升高的響應

3.1.2泥炭地土壤有效氮含量對溫度升高的響應

3.2 溫度和水分變化對泥炭地表層土壤氮循環相關微生物及有效氮含量的影響

3.2.1泥炭地表層土壤氮循環相關微生物對溫度和水分變化的響應

溫度和水分能夠影響土壤中細菌群落的多樣性[42],短期和長期的變化都可能改變土壤細菌的結構和組成[43]。我們發現在增溫條件下,淹水處理使表層土壤nirS和nirK基因豐度降低,可能是因為淹水造成了過度還原的條件,使反硝化底物濃度降低,反硝化微生物活性受到抑制,此研究結果與劉若萱在水田土壤中的研究結果一致,即淹水處理使反硝化微生物nirS和nirK基因豐度降低[18]。溫度和水分交互作用對表層土壤nirS和nirK基因豐度有顯著影響,說明溫度和水分對土壤氮循環nifH、nirK、nirS功能基因豐度的影響不是單方面的,而是二者交互作用的結果。溫度和水分的變化會影響土壤微生物活性及其好氧厭氧狀態,當土壤含水量發生變化時,會引起土壤孔隙度大小發生改變,微生物的活性及其利用有機物的能力受到影響。

3.2.2泥炭地表層土壤有效氮含量對溫度和水分變化的響應

4 結論