基質金屬酶9 在HPV 陰性喉鱗狀細胞癌中的表達特征

李增宏，廖烈強，周 舸，龐藝施，何子鍵，陳偉雄

（佛山市第一人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科1，麻醉科2，廣東 佛山 528000）

喉惡性腫瘤（laryngeal cancer）是發病率僅次于口腔惡性腫瘤的最常見的頭頸惡性腫瘤[1]，其發病率逐年上升[2]。超過90%的喉惡性腫瘤的病理類型為鱗狀細胞癌[2]。隨著醫學技術的不斷發展以及人民對生活質量要求的不斷提高，喉癌的治療目標已不僅僅在于保證生存率，喉功能的保留也日益受到關注[3]。鑒于此，提高喉癌的早期診斷率及探尋改進喉癌的綜合治療策略，成為了業界的研究熱點。癌癥和腫瘤基因圖譜計劃（the cancer genome atlas，TCGA）的研究表明，人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）對于頭頸惡性腫瘤的分子信號通路具有決定性的調控作用[4]。前期研究發現[5]，喉鱗狀細胞癌的HPV 感染率極低，提示針對喉鱗狀細胞癌的發生發展機制研究更應著重于HPV 陰性喉鱗狀細胞癌的相關分子信號通路的研究?；|金屬酶（matrix metallopeptidase，MMP）是一組鋅離子依賴性內肽酶，可調控細胞基底膜的降解，從而促進腫瘤細胞的侵襲、遷移[6]。其中，MMP-9 參與降解細胞基底膜的主要成分——Ⅳ型膠原蛋白，在調控腫瘤細胞轉移尤其是上皮細胞間充質轉變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）中發揮著關鍵作用[7]。研究表明[8]，MMP-9 與喉癌細胞遠處轉移密切相關。然而，目前尚未有研究指出MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細胞癌中的表達情況及作用機制。本研究旨在探明MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細胞癌中的臨床表達特點，探討其應用于早期診斷、預后評估及改善療效的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016 年1 月-2020 年12 月佛山市第一人民醫院收治的喉鱗狀細胞癌患者的臨床數據及組織標本，共計109 例。本研究已獲佛山市第一人民醫院倫理委員會批準，入選患者均簽署同意書。上述病例均獲得病理證實，活檢前均未接受手術治療或放、化療等治療。獲得組織標本后將其保存于-70 ℃超低溫冰箱中。

1.2 DNA 及RNA 提取 在低溫環境下將分別研磨喉癌腫瘤標本及對應癌旁正常組織。研磨后一部分組織按照Promega 公司的Wizard?gnomic DNA purification kit 的說明書流程提取組織DNA。首先在研磨后的組織中加入細胞核裂解液及RNA 酶溶液混合，在37 ℃水浴中放置30 min。其后取上清液并加入100%異丙醇使DNA 沉降，并以70%的乙醇清洗2次以洗脫異丙醇。DNA 沉降物風干后，加入DNA 水化溶液，放置于4 ℃冰箱過夜，制成DNA 溶液。剩余組織按照Invitrogen 公司的TRIZOL 的說明書流程提取組織RNA。首先在研磨后的組織中加入1 ml的TRIZOL 試劑，室溫下放置5 min。加入0.2 ml 氯仿至標本混合液后搖勻，在37 ℃水浴中放置3 min，離心使混合液分層，取上清液與0.5 ml 異丙醇混合，在室溫下放置10 min，離心獲得RNA 沉淀，以1 ml的75%乙醇洗滌2 次。風干RNA 沉淀后以無核酸酶水重新溶解制成RNA 溶液。提取所得的組織DNA及RNA 標本存放于-70 ℃超低溫冰箱中。

1.3 HPV DNA 檢測 按照Qiagen 公司的Digene HC2 HPV DNA test 試劑盒的說明書流程檢測組織標本中的HPV DNA[9]。配平組織標本DNA 濃度后，將標本DNA 樣本分別加入96 孔板的微孔中，加入HPV 特異性探針試劑與樣本混合，利用DML2000型二甘醇微板光度計讀取樣本的HPV DNA 的相對熒光信號值（relative light units，RLUs），并與生產商提供的陽性對照標志物的RLU 值進行比較。當標本的RLU 值高于陽性對照標志物的RLU 值時，標本被定義為“HPV 陽性”；當標本的RLU 值低于陽性對照標志物的RLU 值時，則被定義為“HPV 陰性”。

1.4 cDNA 逆轉錄及RT-PCR 檢測 配平組織標本RNA 濃度后，按照Life technologies 公司的High-Capacity cDNA conversion kit 的說明書流程，將組織樣本的RNA 中加入隨機引物、逆轉錄緩沖液、逆轉錄酶、四種三磷酸脫氧核苷、RNA 酶抑制劑，逆轉錄為cDNA。利用Roche 公司的LightCycler?480 對cDNA 進行RT-PCR 檢測。反應程序：第一階段：95 ℃10 min；第二階段：95 ℃15 s 后60 ℃1 min，共45輪。以GAPDH 作為內參基因，計算MMP-9 cDNA的相對表達量。

1.5 觀察指標 分析HPV 陰性喉鱗狀細胞癌中MMP-9 的表達特點，腫瘤組織及癌旁正常組織中MMP-9 的表達差異，比較MMP-9 表達與患者吸煙、飲酒、TNM 分期的關系。

1.6 統計學分析 利用SPSS 16.0 軟件對上述數據進行統計學分析，計數資料采用（n，%）表示，比較采用χ2檢驗；利用Wilcoxon Signed Rank test 分析腫瘤組織及癌旁正常組織中MMP-9 的表達差異。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床資料及HPV 感染狀況 患者大多為男性，長期吸煙史者較多，聲門型癌占比較高，其次為聲門上型癌，未見聲門下型癌病例，病例以T3、T4期為主，患者均呈HPV 陰性，見表1。

表1 患者臨床資料及HPV 感染狀況[n=109，n（%）]

2.2 MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細胞癌中的表達情況109 例患者中，55 例患者MMP-9 呈高表達，54 例為低表達，其中不同年齡、吸煙、飲酒狀況及臨床分期的HPV 陰性喉鱗狀細胞癌患者MMP-9 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而頸部淋巴結轉移的HPV 陰性喉鱗狀細胞癌的MMP-9 表達高于無頸部淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2；MMP-9 在腫瘤組織中的表達與癌旁正常組織比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 MMP-9 在HPV 陰性鱗狀細胞癌中的表達

表2 MMP-9 在HPV 陰性鱗狀細胞癌中的臨床特點[n（%）]

表2 （續）

3 討論

HPV 感染已被證明是頭頸鱗狀細胞癌的重要致病因素[10]。TCGA 研究表明[4]，在HPV 陽性頭頸惡性腫瘤及HPV 陰性頭頸惡性腫瘤之間，腫瘤信號調控通路具有明顯差異。相較于HPV 陽性的頭頸惡性腫瘤，HPV 陰性的頭頸惡性腫瘤對放化療的敏感度更低，預后更差[11]。本研究針對HPV 陰性喉癌的發生發展機制進行研究，以期為喉癌尤其是HPV 陰性喉癌的早期診斷及精準治療提供理論基礎。在眾多腫瘤信號調控通路中，EMT 相關通路對腫瘤惡性程度具有決定性作用[12]，并與腫瘤復發、放化療抵抗等密切相關[13，14]。鑒于此，對HPV 陰性喉癌的EMT相關通路上的關鍵位點進行調控，對于改善喉癌的預后具有重大意義。

MMP-9 屬于Ⅳ型基質金屬酶，通常以無活性的前體存在于體內，被激活后可分解細胞基底膜的主要成分——Ⅳ型膠原蛋白以及明膠、層粘連蛋白、彈性纖維蛋白、原纖維蛋白、聚蛋白多糖等，使腫瘤細胞突破基底膜屏障，進入血液及淋巴循環系統，并重塑腫瘤細胞的微環境，促進腫瘤細胞完成侵襲、遷移[15]。研究表明，MMP-9 的高表達在早期喉癌便可測得[16]，并與喉癌淋巴結轉移、臨床分期呈正相關[17]，在喉癌的EMT 相關通路中扮演關鍵角色[8]，且與喉癌患者的5 年生存率呈負相關[18]。然而，目前尚無研究指出MMP-9 在HPV 陰性惡性腫瘤中扮演的角色。本研究結果顯示，MMqP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細胞癌中呈高表達。結合MMP-9 的高表達可在喉癌早期便可測得這一特點，MMP-9 有望作為HPV 陰性喉鱗狀細胞癌的早期診斷標志物。另外，MMP-9 的高表達與HPV 陰性喉鱗狀細胞癌腫瘤細胞的淋巴結轉移呈正相關，提示MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細胞癌的發生發展相關信號通路尤其是腫瘤轉移相關通路中扮演重要角色。研究表明，MMP-9 高表達與腫瘤細胞的放化療抵抗密切相關[19-21]。有鑒于此，下調MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細胞癌的表達，有望顯著抑制腫瘤細胞的侵襲轉移能力，上調腫瘤細胞對放化療的敏感性。另一方面，MMP-9 抑制劑，包括巴馬司他、馬力馬司他、MMI270/CGS-27023A、GM6001、GI129471、CGS-25966、普馬司他、利巴馬斯他、鹽酸強力霉素、米諾環素及阿奇霉素已應用于惡性腫瘤的治療中[22，23]，目前已處于Ⅱ期臨床試驗。上述MMP-9 抑制劑也有望應用于HPV 陰性喉鱗狀細胞癌的治療中。

本研究報道了HPV 陰性喉鱗狀細胞癌中MMP-9 的表達特點，但仍有一定的局限性：本研究共計收集109 例病例，標本量充足。但有腫瘤頸淋巴結轉移的病例為28 例，樣本量較少，對研究結果的精確性可能存在影響。未來仍需進行更大規模的有腫瘤頸淋巴結轉移的HPV 陰性喉鱗狀細胞癌的MMP-9 表達量的檢測。

綜上所述，通過調控MMP-9 相關腫瘤轉移通路，有望提高HPV 陰性喉鱗狀細胞癌放化療治療的療效，極有可能改善喉癌患者的預后。未來將開展進一步研究，探明MMP-9 在HPV 陰性喉鱗狀細胞癌發生發展過程中的具體作用機制，為喉癌的精準診治、新型治療提供理論基礎及新的方向。