基于黏蛋白的表達研究慢性阻塞性肺疾病頻繁急性加重型(肺脾氣虛證)的發病特點

朱玉龍 劉莉娟

新疆維吾爾自治區中醫醫院呼吸科，新疆 烏魯木齊 830000

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)在中醫屬于“肺脹、喘證、咳嗽”等范疇，是一種以氣流受限為特征的疾病。氣流受限不完全可逆、呈進行性發展，肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應，使之分泌過多黏液阻塞氣道，從而導致的疾病急性發作。最新的研究結果顯示，中國20歲以上成人的COPD患病率為8.6%，而40歲以上的患病率更是達到了13.7%[1]，影響著我國近一億人的健康，且患病率有逐年上升的趨勢[2-3]。

氣道黏液高分泌是COPD等氣道慢性炎癥性疾病發病機制中最重要的病機之一，臨床上常以痰液的分泌量以及痰液的性質分析作為治療慢性肺部疾病的重要參考指標。呼吸道黏液大量分泌是炎癥反應的結果，而黏液又是細菌良好培養基，斷而形成惡性循環加重炎癥反應和氣流阻塞。黏液通過機械阻塞導致遠端支氣管管腔狹窄、氣流阻塞，還可能通過替換肺泡內表面活性物質致終末細支氣管壁塌陷，從而構成COPD的發病基礎。若能解決氣道黏液高分泌，或者降低黏液的黏稠度，避免黏液栓的形成，將可緩解COPD急性發作所帶來的危害，是目前的研究熱點之一。氣道黏液中主要含有大分子黏蛋白，其是由MUC基因編碼的富含絲氨酸蘇氨酸的高分子量糖蛋白構成[4]。根據其結構不同可分為膜相關性黏蛋白、凝膠形成型分泌性黏蛋白及非凝膠形成型黏蛋白[5]。

常見的分泌型黏蛋白有MUC5AC、MUC5B、MUC7[6]。MUC 5AC是人體氣道高分泌反應的主要物質，其對氣道黏液高分泌反應具有重要的指導意義，是反應杯狀細胞劇烈增值的一項重要指標[7]；MUC5B作為人體氣道內影響纖毛運動的重要組成之一，對煙塵、細菌等外界物質起到運送至體外的作用，若因炎癥反應不能消除，纖毛不能發揮生理作用，則會導致炎癥在氣道內反復發作，造成COPD的逐漸進展[8]；也有學者認為，MUC5B為唾液中的骨架蛋白，能夠包裹唾液中的病毒從而清除，起到非特異性免疫應答的作用[9]。MUC7屬于非凝膠型分泌蛋白，能與細菌結合形成的穩定的二硫鍵，使MUC7能夠更加有效的穩定的清除細菌。同時在唾液中，MUC7擁有多個蛋白靶點，能更加廣泛的覆蓋口腔各部，對口腔各部的細菌等病原體起到清理作用[10]。在以往的研究中并沒有相關報道說明MUC與COPD頻繁急性加重有關，因此本研究通過對COPD急性加重期黏蛋白的變化，探討研究COPD非頻繁急性加重型與頻繁急性加重型(肺脾氣虛證)患者黏蛋白的變化特點。

1 資料與方法

1.1 病例來源 新疆醫科大學附屬中醫醫院2016年1月至2016年12月收住的COPD患者，根據上一年急性加重住院次數分為頻繁急性加重型和非頻繁急性加重型兩組，并招募健康志愿者作為對照組。

1.2 病例選擇標準

1.2.1 西醫診斷標準 慢阻肺的診斷標準[11]：根據GOLD(The Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，慢性阻塞性肺疾病全球倡議)2011修訂版診斷標準：有慢性咳嗽、咳痰、呼吸困難及暴露于危險因素，應用短效支氣管擴張劑后FEV1/FVC%<70%。COPD穩定期標準：患者咳痰、咳嗽、氣促等臨床癥狀輕微或穩定，且近3個月內無癥狀加重情況。

COPD頻繁急性加重型診斷標準[12]：每年發作2次或以上，且每次發作都需要口服糖皮質激素和/或抗生素，或需要住院治療的患者，每三年作為一個預期終點。患者咳痰、咳嗽、氣促或喘息等臨床癥狀加重，且咳痰量逐漸增多。

1.2.2 中醫辨證分型標準 中醫肺脾氣虛證診斷標準[13]：《慢性阻塞性肺疾病中醫診療指南(2011版)》制定。患者中醫辨證屬肺脾氣虛；主癥：咳嗽，喘息，氣短，動則加重，納呆，乏力，易感冒，舌體胖大、齒痕，舌質淡，舌苔白。次癥：神疲，食少，脘腹脹滿，便溏，自汗，惡風，脈沉、細、緩、弱。診斷： ①咳嗽或喘息、氣短，動則加重； ②神疲、乏力或自汗，動則加重；③惡風，易感冒；④納呆或食少；⑤胃脘脹滿或腹脹或便溏； ⑥舌體胖大或有齒痕，舌苔薄白或白膩，脈沉細或沉緩或細弱。具備①、②、③中的2項，加④、⑤、⑥中的2項。

1.3 納入標準 ① 符合慢阻肺西醫診斷標準和穩定期診斷標準；②符合慢阻肺中醫肺脾氣虛證診斷標準；③年齡41～80歲；④患者簽署知情同意書。

1.4 排除標準 ①肺結核、支氣管擴張、間質性肺病等可以引起起到阻塞或者氣流受限疾病的患者；②心、肝、腎功能損害者；③精神疾病患者。

1.5 研究方法

1.5.1 主要試驗儀器及試劑 酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒購自武漢貝茵來生物有限公司，0.4%臺盼藍購自北京雷根生物技術有限公司，二硫蘇糖醇(DTT)溶液購自上海樊克生物科技有限公司，EDTA購自蘇州正洋化工科技有限公司，HE染色液購自北京索萊寶科技有限公司；唾液收集管及唾液采集管均購自上海朗賦實業有限公司的德國莎斯特(SARSTEDT)，Omni-SAI唾液采集片購自英國Cortecs診斷公司，機械式計數機購自浙江紹興醫療器械廠，霧化器購自江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，微量移液器購自德國艾本德股份公司。MUC5AC酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒，MUC5B酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒，Solarbio 伊紅-蘇木蘭染色液，均購自武漢貝茵萊生物有限公司。

1.5.2 唾液的誘導處理 受檢對象于清晨檢測前30 min內禁食水，并在擬收集標本時，用清水漱口，再讓患者口含英國Cortecs診斷公司的Omin-SAI唾液采集片，待采集片變為藍色后，將其放置專用管內，室溫下采用酶聯免疫法吸附法對唾液中黏蛋白MUC5B、MUC7含量進行檢測，試驗過程嚴格按照試劑說明書上的操作進行。

2 統計方法

3 結果

3.1 患者基本資料 COPD頻繁急性加重型組共納入患者60例，其中男性30例，女性30例，年齡47～79歲，平均年齡(65.56±7.92)歲，病程2～20年，平均(9.5±1. 9)年；COPD非頻繁急性加重型共納入患者60例，其中男性30例，女性30例，年齡45～76歲，平均年齡(65.45±6.92)歲，病程3～19年，平均(9.3±1.7)年；健康人群納入60例，其中男性30例，女性30例，年齡45～77歲，平均年齡(65.85±6.95)歲。兩組以上資料在性別、年齡、病程等方面未見統計學差異(P>0.05)。

3.2 正常人、COPD非頻繁急性加重型、頻繁急性加重型患者唾液中MUC5B、MUC7的比較 與正常人唾液比較，非頻繁急性加重期及頻繁急性加重期患者唾液上清液中的黏蛋白MUC5B、MUC7的含量均升高，組間比較，差異有顯著性統計學意義(P<0.01)；與非頻繁急性加重期患者唾液比較，頻繁急性加重期患者唾液上清液中的黏蛋白MUC5B、MUC7的含量均升高，組間比較，差異有顯著性統計學意義(P<0.01)。結果見表1。

表1 正常人、非頻繁急性加重型、頻繁急性加重型患者唾液中MUC5B、MUC 7的比較

3.3 正常人、COPD非頻繁急性加重型、頻繁急性加重型患者唾液上清液中各細胞總數的比較 與正常人唾液比較，非頻繁急性加重型及頻繁急性加重型患者唾液中的中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數量均顯著高于正常人，組間比較，差異有顯著性統計學意義(P<0.01)；與非頻繁急性加重型患者唾液比較，頻繁急性加重型患者唾液上清液中的中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數量均顯著高于非頻繁急性加重型患者，組間比較，差異有顯著性統計學意義(P<0.01)。結果見表2。

表2 正常人、非頻繁急性加重型、頻繁急性加重型患者唾液上清液中各細胞總數的比較 (個，

4 討論

COPD在中醫學中被稱為“肺脹”。“肺脹”一詞的提出最早是在《靈樞·脹論》中，“肺脹者，虛滿而喘咳”[14]。張仲景在《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》中進一步描述了肺脹的病機及癥狀，本病的病機以肺脾腎虧虛為本，痰瘀互結為標，二者共同引起的本虛標實；《素問·咳論》中提到，“五臟六腑，皆令人咳，非獨肺也”，淺析其意，脾臟為后天之本，生化之源，運化水谷精微，內養五臟六腑，外養四肢百骸，脾精不濡，肺失所養，乃致其病[15]。俞琪等[16]對既往報道的肺脹的證型進行歸納發現，肺脾氣虛在COPD的證型占比最高，臨床中亦有醫家在研究中得出相似的結論。中醫研究發現 COPD 頻繁急性加重型穩定期的主要病位在肺、脾、腎三臟，其根源在于肺氣虧虛，肺脾二臟為母子關系，“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”，肺脾二臟氣虛及痰的存在構成 COPD 的主要發病基礎，肺脾氣虛證是其主要證型之一，因此，雖COPD在發病中證型各不相同，但臨床中以肺脾氣虛多見。

COPD的發病與氣道黏液的高分泌有關，在COPD患者使用化痰藥物時，會影響黏蛋白的產生，從而減輕黏液高分泌的狀態[17]。因此，氣道的黏液分泌是引發疾病的重要因素之一[18-19]。本實驗從COPD非頻繁急性加重型和頻繁急性加重型患者分別與體檢健康人群的唾液中MUC7及MUC5B的分泌對比發現，COPD非頻繁急性加重型和頻繁急性加重型患者的黏蛋白均高于正常人組，在MUC5B中非頻繁急性加重型患者稍高于正常人群，頻繁急性加重型患者明顯升高，更具有指導意義。MUC7在非頻繁急性加重型及頻繁急性加重型均明顯高于正常人群，在唾液中更具有代表性，患者頻繁急性加重型的MUC5B及MUC7均明顯高于非頻繁急性加重型患者，提示頻繁急性加重型氣道黏液高分泌狀態較非頻繁急性加重型患者更為強烈。

COPD的疾病發展除對氣道黏液高分泌相關外，也與炎癥細胞反應分泌的介質密切相關。主要由嗜中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥。其中炎癥反應與中性粒細胞呈正相關關系[20]，當急性發作期時，中性粒細胞與主要的趨化因子IL-8相結合，引起中性粒細胞的趨化，變形釋放，進一步導致炎癥的形成。COPD頻繁急性發作期時，肥大細胞激活嗜酸性粒細胞趨化因子[21]，使細胞聚集，引起炎性細胞介質的釋放，加重炎癥反應。而MUC5B作為人體氣道內影響纖毛運動的重要組成之一，對煙塵、細菌等外界物質起到運送至體外的作用，若因炎癥反應不能消除，纖毛不能發揮生理作用，則會導致炎癥在氣道內反復發生，造成COPD的逐漸進展[8]，進而加重COPD患者的病情。本實驗研究發現，在COPD頻繁急性加重型及非頻繁急性加重型患者唾液中中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞均高于體檢正常人群，差異有統計學意義，且COPD兩組患者均為成倍增高，其中頻繁急性加重型患者的炎癥因子高于非頻繁急性加重型患者，提示COPD組患者體內慢性炎癥的存在，并且在頻繁急性加重型患者中，其慢性炎癥更為嚴重，這對于臨床醫者指導用藥有更重要的意義，在頻繁急性加重型及非頻繁急性加重型患者中均要考慮慢性炎癥的用藥，同時，在頻繁急性加重型中，要加強抗炎的治療，以使臨床治療COPD收獲更好的療效。