蒙藥自擬處方泵嘎日-17的質量標準相關性研究

王懷剛 王懷偉 白雅靜

1.呼倫貝爾市食品藥品檢驗所，內蒙古 呼倫貝爾 021000； 2.內蒙古自治區扎蘭屯市人民醫院，內蒙古 扎蘭屯 162650

泵嘎日-17為呼倫貝爾市中蒙醫院自制制劑，處方由黃柏、麥冬、人工牛黃、熊膽粉、紫花地丁等17味藥組成，具有清熱解毒的功效，臨床適用于急性膽囊炎的治療，在蒙醫醫院臨床為長期使用的制劑，臨床療效顯著[1]。蒙醫學認為，膽為希拉之物質基礎，具有消化之功能，據希拉之位的腑器，也是病變希拉竄行之道。因此，膽病多由希拉熱引起。據《四部醫典》記載“當醫治肺、肝、膽病時，應以清熱邪為主”[2]。方中熊膽具有清熱解毒、止痛、明目之功效，臨床用于治療肝熱熾盛，熱極生風所致的驚風，抽搐。肝熱，目赤腫痛， 以及用于瘡癰腫痛等癥[3]。而黃柏具有清熱燥濕、瀉火解毒、消腫祛腐的功效。臨床用于治療濕熱瀉痢、黃疸、帶下、熱淋、痔漏、盜汗、遺精等癥[4]。兩味藥在本方治療急性膽囊炎中發揮主藥作用。研究采用薄層色譜法和高效液相色譜法對制劑中的熊膽和黃柏進行定性與定量研究，經方法驗證確定了理想的實驗條件，表明該方法重現性好，專屬性強，并且方中其他成分無干擾，對泵嘎日-17的質量控制起到了很好的效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器 KQ5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D 型電子分析天平；Sartorius BS224S型電子分析天平；202型電熱恒溫干燥箱(北京市永光明醫療儀器廠)；島津LC-20AT高效液相色譜儀。

1.2 材料 泵嘎日-17制劑由呼倫貝爾市中蒙醫院制劑室提供；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-201212 含量：86.7%)、熊去氧膽酸對照品(批號：110755-201704)、鵝去氧膽酸對照品(批號：110806-201708)和膽酸對照品(批號：100078-201415)均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 熊膽的薄層色譜鑒別

2.1.1 對照品溶液的制備 取熊去氧膽酸、膽酸、鵝去氧膽酸對照品，分別加甲醇制成每1 mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備 取本品粉末1g，加30 mL甲醇，溫熱使溶解，放冷，過濾，濾液蒸干，加10 mL氫氧化鈉溶液(1→ 5)，加熱回流1 h，放冷，滴加稀鹽酸調節pH值2～3后，乙酸乙酯試劑振搖提取4次，每次10 mL，合并提取液，蒸干，殘渣用2 mL甲醇溶解，作為樣品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 取1g不含熊膽的處方樣品，同樣品的制備方法制成熊膽陰性對照溶液。

2.1.4 薄層色譜條件及結果 照薄層色譜法[5](《中國藥典》2015年版四部通則0502)，吸取供試品溶液2 μL、對照品溶液2 μL、陰性對照品2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙醚-冰醋酸-正丁醇-水(10∶5∶5∶3∶1)的上層溶液展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱約10 min。置紫外光燈365 nm下檢視(溫度：27 ℃；濕度：32%)。結果樣品色譜中，在與熊去氧膽酸、膽酸、鵝去氧膽酸對照品的相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結果如圖1所示。

圖1 泵嘎日-17中熊膽薄層色譜圖

2.2 黃柏的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適應性條件 填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(25∶75)，流速為1 mL/min，檢測波長為265 nm，理論塔板數按鹽酸小檗堿峰計算應不低于4000。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿對照品適量，加鹽酸-甲醇(1∶100) 的混合溶液制成每1 mL含50 ug的溶液，即得。

2.2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱定本品細粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率140 W,頻率4 kHz)，放冷，再稱定重量，用上述混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 專屬性考察 分別取陰性樣品供試溶液(除不加黃柏外其余幾份藥材按原方配比)、泵嘎日-17供試樣品溶液、鹽酸小檗堿對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀。按上述色譜條件進行實驗，結果顯示，陰性樣品對鹽酸小檗堿含量測定結果無干擾。結果如圖2所示。

A.鹽酸小檗堿對照品溶液；B.泵嘎日-17供試樣品溶液；C.陰性樣品供試溶液圖2 專屬性考察高效液相色譜圖

2.2.4 線性范圍 精密稱定鹽酸小檗堿對照品2.5 mg(實際取2.565 mg)，置10 mL量瓶中，加(鹽酸-甲醇 1∶100)使溶解并稀釋至刻度，搖勻(相當于0.2565 mg/mL)。精密吸取上述對照品溶液0.5、1、2 mL分別置25 mL量瓶中，吸取2 mL、3 mL分別置10 mL量瓶中，加(鹽酸-甲醇1∶100)混合溶液至刻度，搖勻，配置成濃度為 5.13、10.26、20.52、51.30、76.96 μg/mL的標準系列，按上述色譜條件測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：Y=25890X-27638.8，R2=0.9992，n=5。結果表明鹽酸小檗堿在濃度為 5.13～76.96 μg/ mL 范圍內呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度 取同一批號樣品(批號：20190912)6份，按樣品溶液制備方法制備樣品，照上述色譜條件及方法進行測定每份樣品的含量，平均含量為2.2366 mg/g，RSD為1.81%表明該方法重復性良好。

2.2.6穩定性試驗 精密吸取樣品溶液5 μL，按上述色譜條件，分別于制備0、2、4、8、10、12 h進行色譜測定，記錄色譜峰面積，從數據可見，樣品中鹽酸小檗堿在12 h內峰面積基本穩定不變，RSD為0.9%(n=6)。

2.2.7 加樣回收率試驗 取已知鹽酸小檗堿含量的樣品(批號：20190912 含量為2.2366 mg/g)粉末6份，每份約為0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入用(鹽酸-甲醇1∶100)混合溶液配制的鹽酸小檗堿對照品溶液(C=0.5029 mg/mL)1、1、1、2、2、2、4、4、4 mL，按照樣品溶液制備方法制備樣品溶液。按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，計算回收率，平均回收率為95.6%，RSD為1.8%(n=9)。結果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗結果

2.2.8 耐用性實驗 用不同型號，不同廠家的色譜柱，取樣品重0.5026 g的供試品，按樣品溶液制備方法制備樣品，以上述色譜條件進樣，測定含量。結果見表2。

表2 不同色譜柱的耐用試驗

2.2.9 樣品測定 依據建立的鹽酸小檗堿含量測定方法，對三批次(批號為20190920、20190912、20190905)泵嘎日-17中的鹽酸小檗堿含量進行測定。樣品測定結果見表3。

表3 三批樣品中鹽酸小檗堿含量測定結果

2.2.10 藥材含量的測定 同法對生產上述三批樣品的黃柏藥材進行了含量測定，鹽酸小檗堿的含量結果為39.3166 mg/g。測定結果見表4。

表4 三批樣品中黃柏鹽酸小檗堿的含量測定結果

3 討論

3.1 指標成分的選擇 黃柏具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，用于治療濕熱泄痢、黃疸尿赤、骨蒸勞熱等癥，而熊膽具有清熱解毒、息風止痙、清肝明目的功效，其所含膽汁酸鹽可顯著增加膽汁分泌量，對總膽管、括約肌有松弛作用，鵝去氧膽酸有溶解膽結石的作用[6]。二者均對膽囊炎具有一定的治療作用，故選擇二者進行泵嘎日-17的質量控制指標。

3.2 含量測定檢測波長的選擇 通過考察鹽酸小檗堿的紫外光譜得出，鹽酸小檗堿在265 nm處有最大吸收，故含量測定選用265 nm作為含量測定的檢測波長。

3.3 含量測定流動相的選擇 前期預試驗分別考察了甲醇-水(25∶75)、乙腈-水(25∶75)、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(25∶75)、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(25∶75)作為流動相，結果選用甲醇-水、乙腈-水為流動相時，鹽酸小檗堿色譜峰型不理想，拖尾較嚴重；而甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀作為流動相時，由于甲醇在低波長處對鹽酸小檗堿色譜峰型有干擾，沒有乙腈作為流動相時的色譜峰理想，故選用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(25∶75)作為流動相。

3.4 含量測定提取方法的選擇 參照了2015年版《中國藥典》大補陰丸的含量測定方法[7]，分別考察了以鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液為提取溶劑，15、30、45、45、60、75 min超聲處理提取，結果發現鹽酸小檗堿在超聲提取30 min后含量基本不變，故確定超聲提取時間為30 min。

3.5 含量測定轉移率和含量范圍 從樣品含量測定結果和生產對應批次樣品的藥材含量測定結果分析比較，通過轉移率與2015年版《中國藥典》一部中黃柏鹽酸小檗堿含量限值計算[7]，擬定泵嘎日-17中黃柏以鹽酸小檗堿計，不得少于1.4 mg/g。

綜上，研究利用薄層色譜法和高效液相色譜法，分別對泵嘎日-17中主藥熊膽和黃柏進行了定性定量測定，建立了泵嘎日-17中熊膽和黃柏的質量控制方法，通過試驗研究結果看出，薄層色譜對熊膽的定性鑒別方法科學、簡便、專屬性強；高效液相色譜法對黃柏的定量鑒別方法科學、穩定、重現性好。故本研究可對蒙藥制劑泵嘎日-17的質量控制提供方法學基礎，對促進蒙藥標準化，提高蒙藥發展水平具有一定的積極意義。