茵梔黃護(hù)肝顆粒制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

李小偉 栗進(jìn)才 陳云飛 張 松 劉旭東 葛 君

1.安徽省蒙城縣中醫(yī)院，安徽 蒙城 233500；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800

茵梔黃護(hù)肝顆粒是蒙城縣中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由垂盆草、半枝蓮、白花蛇舌草、虎杖、枳殼、生梔子、茵陳、五味子等藥物組成，具有健脾滲濕、疏肝理氣、清熱解毒、活血養(yǎng)血的功效。經(jīng)過(guò)10多年的臨床證明，在慢性乙肝、丙型肝炎、乙肝病毒攜帶者、肝硬化腹水等病癥，療效確切，未見(jiàn)明顯的不良反應(yīng)。在10多年的臨床應(yīng)用中，是以湯劑為主，將其開(kāi)發(fā)為顆粒劑，既保持了傳統(tǒng)湯劑吸收快、顯效迅速的優(yōu)點(diǎn)，又克服了患者服用前需要臨時(shí)煎煮，費(fèi)時(shí)耗能，久貯易發(fā)生霉變、不便于服用、貯存、攜帶等問(wèn)題，提高患者用藥的依從性。本文通過(guò)單因素考察，解決了顆粒劑在制備過(guò)程中存在的溶化性、吸濕性、成型性、色澤不均勻等問(wèn)題，優(yōu)化出茵梔黃護(hù)肝顆粒的制備工藝，并建立其質(zhì)量控制方法。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀Thermo U3000(美國(guó)賽默飛)；SQP(規(guī)格：SECURA225D-1CM)型十萬(wàn)分之一電子天平(賽托利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；JK-500DVE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司)；WFH-203三用紫外儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；

1.2 試藥 茵梔黃護(hù)肝顆粒(批號(hào)：20190401、20190402、20190403)；梔子苷對(duì)照品(批號(hào)：110749-201718，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；佛手對(duì)照藥材(120933-201706，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；鹽酸小檗堿對(duì)照品(110713-201814，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；色譜乙腈(美國(guó)天地)；糊精、蔗糖( 均購(gòu)于曲阜市藥用輔料有限公司，批號(hào)：20190109F)，甲醇、乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 茵梔黃護(hù)肝顆粒劑的制備 按處方量取原料藥材，加水煎煮二次，第一次加10倍量水煎煮2 h，第二次加8倍量水煎煮1 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.4～1.6(80 ℃)的稠膏，稠膏∶糊精∶糖粉(1∶0.8∶2.4)混勻制軟材，制粒(10目篩)，干燥(70 ℃)，制成1000 g，即得。

2.2 溶化性的測(cè)定 照中國(guó)藥典2015版四部規(guī)定的可溶性顆粒檢查法，取供試品10 g，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，可溶顆粒在4 min內(nèi)全部溶化或有輕微渾濁。

2.3 輔料種類(lèi)的篩選 由于本品藥材提取所得的稠膏粘性大，無(wú)法直接干燥成干膏，因而本制粒工藝采用稠膏加輔料制粒。對(duì)于水溶性顆粒劑，目前最常用的輔料為蔗糖粉及糊精。糖粉系蔗糖結(jié)晶的細(xì)粉，是可溶性顆粒劑的優(yōu)良賦形劑，并有矯味及粘合作用。糊精系淀粉的水解產(chǎn)物，亦是可溶性顆粒劑的較常用的賦形劑，在傳統(tǒng)顆粒劑的生產(chǎn)工藝中，常與糖粉共用作為其輔料。其他尚有乳糖、可溶性淀粉、甘露醇等，但因其來(lái)源及價(jià)格等因素，在傳統(tǒng)顆粒劑生產(chǎn)中，目前使用還不多。另考慮到制粒的吸濕性及成型性問(wèn)題，故本實(shí)驗(yàn)選擇稠膏、糊精、糖粉按一定的比例混合制粒。

2.4 輔料配比的考察 通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，稠膏與輔料按1∶1比例混合(糊精∶糖粉，1∶1)混合，不易制粒，其成型性較差且易吸濕，本實(shí)驗(yàn)選擇以下4個(gè)比例對(duì)輔料比進(jìn)行考察，記錄各比例條件下的結(jié)果，其比例見(jiàn)表1。并以制粒情況及顆粒的口感、成型率、溶化性、吸濕率等為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而篩選出最優(yōu)的輔料配比。

表1 輔料用量配比

2.5 顆粒的成型率和溶化性的比較 顆粒的成型率根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》對(duì)顆粒劑粒度的要求，不能通過(guò)1號(hào)篩與能通過(guò)五號(hào)篩的總和不得超過(guò)15%。因此分別取“2.1”項(xiàng)下制得的顆粒依次過(guò)1號(hào)篩和5號(hào)篩，收集能通過(guò)1號(hào)篩而不能通過(guò)5號(hào)篩的顆粒，稱(chēng)重，按“成型率=通過(guò)1號(hào)篩而不能通過(guò)5號(hào)篩的顆粒重/樣品顆粒重×100%”公式，分別計(jì)算4種不同輔料配比下制得的顆粒的成型率。另根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》四部中對(duì)可溶性顆粒劑溶化性的要求，分別稱(chēng)取4份不同輔料配比下制得的顆粒約10 g，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察顆粒的溶化情況。由結(jié)果可知，當(dāng)稠膏與糊精、糖粉按1∶0.8∶2.4比例混合，制得的軟材成型好，易過(guò)篩，顆粒粒徑合適，收率較高，口感較佳，而且全部溶化。結(jié)果如圖1、表2。

圖1 不同輔料配比制成顆粒比較圖

表2 不同輔料配比試驗(yàn)結(jié)果

2.6 吸濕性的考察 將底部盛有氯化鈉過(guò)飽和溶液的玻璃干燥器放入25 ℃恒溫箱內(nèi)恒溫96 h，此時(shí)干燥器內(nèi)的相對(duì)濕度為75%，分別精密稱(chēng)取4份不同輔料配比下制得的顆粒，約1 g，放入已恒重的稱(chēng)量瓶底部，輕搖使其分布均勻，精密稱(chēng)定，稱(chēng)量瓶蓋揭開(kāi)，置于盛有NaCl過(guò)飽和溶液的玻璃干燥器內(nèi)，于25 ℃恒溫箱保存，定時(shí)稱(chēng)量，按下式計(jì)算吸濕百分率。結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同輔料配比吸濕率的比較圖

2.7 制粒工藝條件的驗(yàn)證 取3份稠膏，優(yōu)化的制備工藝，制備3批顆粒劑，以軟材及制粒情況、顆粒的成型率及溶化性為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量檢查，考察工藝的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：三份處方所制得的顆粒，從顆粒成型性、收率、溶化性等指標(biāo)來(lái)看，該工藝較為穩(wěn)定。

表3 制粒工藝條件的驗(yàn)證

2.8 薄層鑒別

2.8.1 梔子[1]

2.8.1.1 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.8.1.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取本品(批號(hào)：20190401、20190402、20190403)10 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液置于水浴上蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。

2.8.1.3 陰性供試品溶液的制備 按處方配比稱(chēng)取除梔子外的其它藥材，按茵梔黃護(hù)肝顆粒制備方法制成不含梔子的陰性樣品，按試品溶液的方法制備陰性樣品供試液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板，以三氯甲烷-甲醇(3∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾，專(zhuān)屬性強(qiáng)，如下圖a所示。

2.8.2 佛手[2-3]

2.8.2.1 對(duì)照藥材溶液制備 稱(chēng)取佛手對(duì)照藥材1 g，加無(wú)水乙醇10 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，取濾液置于水浴上蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇0.5 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.8.2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取本品(批號(hào)：20190401、20190402、20190403)40 g，研細(xì)，加無(wú)水乙醇60 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液置于水浴上蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。

2.8.2.3 陰性供試品溶液的制備 按處方配比稱(chēng)取除佛手外的其它藥材，按茵梔黃護(hù)肝顆粒制備方法制成不含佛手的陰性樣品，按試品溶液的方法制備陰性樣品供試液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(3∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置于365 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾，專(zhuān)屬性強(qiáng)，如下圖b所示。

2.8.3 黃連[4-5]

2.8.3.1 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.8.3.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取本品(批號(hào)：20190401、20190402、20190403)10 g，研細(xì)，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.8.3.3 陰性供試品溶液的制備 按處方配比稱(chēng)取除黃連外的其它藥材，按茵梔黃護(hù)肝顆粒制備方法制成不含黃連的陰性樣品，按試品溶液的方法制備陰性樣品供試液。

照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板，以正丁醇-乙酸-水(7∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出；晾干，于365 nm紫外燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾，專(zhuān)屬性強(qiáng)，如下圖c所示。

2.9 含量測(cè)定

2.9.1 對(duì)照品溶液的制備 取梔子苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含34.2 μg的溶液，即得。

2.9.2 供試品溶液的制備[6-7]取裝量差異項(xiàng)下的本品(批號(hào)：20190401)，研細(xì)，取約5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲提取20 min，放冷濾過(guò)，濾液轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，另精密量取10 mL于25 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得。

2.9.3 陰性樣品的制備按處方比例及生產(chǎn)工藝制備 不含梔子的茵梔黃護(hù)肝顆粒，再按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液，即得。

2.9.4 含量測(cè)定的色譜條件 色譜柱為碳十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；以乙腈-0.2%磷酸(10∶90)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。見(jiàn)圖3所示。

2.9.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為0.0342 mg/mL的對(duì)照品溶液6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，按上述色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程y=24.8424x+0.3737(R2=0.9984)，表明梔子苷在0.2052～0.4788 mg濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.9.6 精密度考察 精密吸取濃度為0.0342 mg/mL的對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積，梔子峰面積RSD=0.08%，表明儀器精密度良好。

2.9.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)的本品6份，每份約5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，梔子苷含量的RSD=0.37%,表明方法重復(fù)性良好。

2.9.8 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取本品5 g，精密稱(chēng)定，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液。分別于配制后0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積,梔子苷峰面積RSD=0.20%，表明樣品在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的樣品6份(每份約2.5 g)，精密加入梔子苷對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

A：對(duì)照品； B：陰性樣品；C：供試品圖3 茵梔黃護(hù)肝顆粒中梔子苷的HPLC圖

表4 梔子苷含量測(cè)定加樣回收率試驗(yàn)

由上表知，樣品平均回收率為99.19%，RSD=0.13%。表明方法準(zhǔn)確度較高。

2.10 樣品測(cè)定及含量限度的確定 稱(chēng)取茵梔黃護(hù)肝顆粒樣品3批(批號(hào)：20190401、20190402、20190403)適量，精密稱(chēng)定，按照2.9.2供試液制備方法制備供試液，按2.9.4色譜條件測(cè)定，測(cè)得梔子苷含量分別為0.8511、0.8389、0.8483 mg/g，而《中國(guó)藥典》2015版一部規(guī)定梔子含量(以梔子苷計(jì))應(yīng)不低于1.5%(15 mg/g)。由處方計(jì)算，樣品含梔子生藥0.06 g/g，故成品理論最低含量為0.9 mg/g。制成制劑后，藥材轉(zhuǎn)移率在49.08～51.23%，工藝較為穩(wěn)定。故成品最低含量范圍為0.44～0.46 mg/g。從三批樣品并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際考慮，故本標(biāo)準(zhǔn)梔子苷最低限量暫定為0.45 mg/g。

3 討論

3.1 劑型的選擇 茵梔黃護(hù)肝顆粒劑是在傳統(tǒng)湯劑的基礎(chǔ)上，由我院名老中醫(yī)在經(jīng)典名方的基礎(chǔ)上根據(jù)多年臨床驗(yàn)證進(jìn)行加減，經(jīng)過(guò)反復(fù)的工藝和劑型的對(duì)比研究，選擇顆粒劑，既保留了傳統(tǒng)湯劑的療效和特色，又方便于患者服用、攜帶、貯藏等。

3.2 制備工藝配比的選擇 通過(guò)吸濕性和成型性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在相同溫度25 ℃，濕度75%的環(huán)境下，不同配比制備的顆粒，成型性和吸濕率差異較大，其中比例三和比例四相差較小，但考慮到實(shí)際生產(chǎn)和藥物的有效性， 最終選擇稠膏∶糊精∶糖粉(1∶0.8∶2.4)的配比，顆粒成型性好，吸濕率低，便于顆粒的制備和貯存。

3.3 輔料的選擇 由于本方采用稠膏加輔料制粒的傳統(tǒng)工藝，中藥顆粒劑常用的輔料有糊精、乳糖、糖粉等，由于乳糖成本高，價(jià)格較為昂貴，不適合大面積推廣；糊精能溶于熱水，黏合力強(qiáng)；庶糖味甜，黏合力強(qiáng)；結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和參考文獻(xiàn)，選擇稠膏∶糊精∶糖粉(1∶0.8∶2.4)配比制備顆粒。此外，稠膏兼有粘合劑的作用，不需另外加入適量潤(rùn)濕劑或粘合劑，可以省去干燥工藝，節(jié)約時(shí)間，適用于生產(chǎn)。輔料選用的庶糖兼有矯味劑作用，不需要另外加入矯味劑。結(jié)果顯示：本方制備的顆粒成型性、吸濕性、溶化性、顆粒的性狀、色澤均能滿(mǎn)足顆粒劑的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.4 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇 由于茵陳、梔子、垂盆草、均為本方的君藥，其中茵陳定量目標(biāo)成分為綠原酸、濱蒿內(nèi)酯，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，綠原酸在專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)干擾，專(zhuān)屬性不強(qiáng)；垂盆草含有定量研究成分槲皮素、山奈素、異鼠李素，在研究過(guò)程中，專(zhuān)屬性不強(qiáng)，半枝蓮的研究指標(biāo)為野黃芩苷，其操作方法與梔子苷相比，方法較復(fù)雜，同時(shí)，茵梔黃護(hù)肝顆粒是采用傳統(tǒng)水提取法的制備工藝，可以有效提取梔子中梔子苷含量，轉(zhuǎn)移率高，故選擇梔子苷作為茵梔黃護(hù)肝顆粒含量測(cè)定指標(biāo)成分，建立含量測(cè)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)單、更能保證臨床用藥的安全和有效。

3.5 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-水[8-9]、乙腈-0.5%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液[11]、選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液四種流動(dòng)相，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果峰型和分離度表明，選擇乙腈-0.2%磷酸(10∶90)條件下，峰型和分離度良好，明顯優(yōu)于其他流動(dòng)相效果。

3.6 貯藏條件的選擇 本制劑是由中藥水提物濃縮成稠膏，與輔料混合制備的顆粒劑，由于中藥水提物中含糖量較高，所以容易吸濕而產(chǎn)生結(jié)塊，因此在生產(chǎn)、整粒、包裝、貯藏過(guò)程中，一定要控制環(huán)境溫濕度，因此筆者考察在溫度為25 ℃，濕度為75%條件下顆粒抗吸濕度，考察結(jié)果較好，為顆粒劑的貯藏提供了依據(jù)。