3種抗心血管病中成藥對大鼠肝微粒體CYP450 4 種亞型的體外活性影響研究

黃茹潤 楊 嬌 劉 姍 母育成 賴 泳

大理大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，云南 大理 671000

隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的改變，加之社會人口老齡化，心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率已明顯增多，嚴(yán)重威脅著人類的健康，目前主要以化學(xué)藥治療心血管疾病，但化學(xué)藥的不良反應(yīng)會限制其使用，如噻嗪類利尿藥可能導(dǎo)致低血鉀、高尿酸、高血糖；腎素-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類藥物易產(chǎn)生干咳；鈣拮抗劑可能引起外周水腫、便秘、心悸、面部潮紅；β受體阻滯藥可能使糖尿病病人產(chǎn)生低血糖、乏力；硝酸酯類藥可能導(dǎo)致頭痛、心率放射性加快、低血壓；抗血小板藥物可能引起肝臟損害和肌病等[1]，而中藥和中藥制劑因其溫和、持久的治療作用，以及多途徑、多靶點的治療特點，使其在抗心血管疾病中得到廣泛使用[2]。由中藥-中藥、中藥-西藥聯(lián)合用藥引起CYP450酶(CYPs)的誘導(dǎo)/抑制，產(chǎn)生的藥物相互作用明顯增加[3]，因此評價臨床常見中成藥對CYPs的體外活性影響，對于臨床安全用藥、降低藥-藥相互作用的風(fēng)險有重要的意義。本研究通過前期大量查閱文獻(xiàn)及對大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院、大理州人民醫(yī)院及大理市第一人民醫(yī)院3家醫(yī)院走訪，選出常用于抗心血管疾病且多與西藥聯(lián)合應(yīng)用的3種中成藥：參松養(yǎng)心膠囊(Shensong yangxin capsule，SS)、芪藶強心膠囊(Qili Qiangxin capsule，QL)和通脈養(yǎng)心丸(Tongmai yangxin pill，TM)，但以上三藥對肝臟 CYPs 有無影響尚未見報道，且人的CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4與大鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP2D1、CYP3A1存在同源性[4]，鑒于此，本課題采用“Cocktail”探針?biāo)幬锓ǎw外評價大鼠肝微粒體中 3 種常見抗心血管病中成藥對 CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP3A4 酶的抑制活性，為預(yù)測臨床上此 3 種常見抗心血管病中成藥與以CYPs 4種亞酶為底物的藥物合用時可能產(chǎn)生的相互作用提供實驗數(shù)據(jù)，為臨床藥物的合理應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器 EL-304電子分析天平(Mettler Toledo)；pH計(上海雷磁)；色譜：Agilent 1260 HPLC工作系統(tǒng) (美國Agilent 公司)；TARGIN VX-III多管渦旋震蕩器(中國北京踏科技有限公司)；3-15臺式高速離心機(jī)(美國Sigma)。

1.2 試劑及藥品 咖啡因(中國食品藥品檢定研究院，批號20161014)；奧美拉唑(批號G1325050)和美托洛爾(批號C1729022)均購自阿拉丁；咪達(dá)唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號20170328)；地西泮注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號AH160602)；α-萘黃銅(批號O0506A)、奎尼丁(批號A1210A)、酮康唑(批號J0620AS)、氟康唑(批號O0615AS)均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；參松養(yǎng)心膠囊(北京以嶺藥業(yè)有限公司，批號1703008)；芪藶強心膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號A1704018)；通脈養(yǎng)心丸(樂仁堂制藥廠，批號1070275)。

1.3 實驗動物 雄性SD大鼠10只，體重(200±20) g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供(SYXK湘2013-0004)。

2 方法

2.1 溶液配制 內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密量取2 mL地西泮注射液(5 mg·mL-1)，超純水定容于5 mL容量瓶，得2.00 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備液。精密量取適量內(nèi)標(biāo)儲備液，甲醇-乙腈(1∶1)稀釋成8 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

三種中成藥溶液配制：精密稱取SS、QL、TM各20 mg，加甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，得400 μg·mL-1待測藥物液，臨用時采用倍比稀釋法配制為200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1溶液。具體操作[5]：采用96孔板，先向第1孔加入100 μL 400 μg·mL-1的待測藥物液，吸走50 μL加入第2孔，向第2孔加入50 μL甲醇，混勻后吸走50 μL加入到第3孔，再向第3孔加入50 μL甲醇，混勻后吸走50 μL加入到第4孔，依此類推，直到第7孔，則第1孔至第7孔的藥物濃度分別為：400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg·mL-1。

2.2 大鼠肝微粒體制備 鈣沉淀法[6]制備肝微粒體：取出大鼠肝臟稱重，剪碎，用KCl磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)反復(fù)沖洗后，按1∶4(W/V)加入50 mmol·L-1Tris-1.15 % KCl緩沖溶液，冰上勻漿，然后4 ℃，10000 r/min，離心20 min，取上清液加入適量CaCl2溶液(1∶1，V∶V)后再以4 ℃，14000 r/min，離心40 min，棄上清，沉淀加入 1 mL 上述KCl緩沖液混勻，4 ℃，14000 r/min，離心20 min，紅色沉淀即為肝微粒體。將其懸浮于 PBS-20 % 甘油緩沖液中，分裝至EP管中，采用BCA法，測定肝微粒體蛋白含量并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1% 甲酸水溶液(B)，洗脫程序：0～8 min，A為10 %～ 40 %；8～15 min，A為40 %～ 45 %；15～30 min，A為45 %～ 35 %；30～35 min，A為35 %～20 %；35～40 min，A為20 %～ 10 %。流速0.5 mL·min-1；檢測波長280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.4 樣品處理 參考文獻(xiàn)[7]處理樣品，加入10 μg·mL-1地西泮內(nèi)標(biāo)500 μL，渦旋混勻1 min，12000 r/min離心10 min,取上清液200 μL，進(jìn)樣20 μL。

2.5 探針底物與大鼠肝微粒體體外反應(yīng)及HPLC法測定 孵育體系總體積500 μL，包含15 μL大鼠肝微粒體蛋白(0.5 mg·mL-1)，10 μL NADPH再生系統(tǒng)(1 mmol·L-1NADP+，10 mmol· L-1G-6-P，1 U·mL-1G-6-PDH)，472.5 μL PBS緩沖液(pH=7.4)，2.5 μL混合探針底物(15.04 μmol·L-1咖啡因、7.81 μmol·L-1美托洛爾、4.98 μmol·L-1奧美拉唑和6 μmol·L-1咪達(dá)唑侖)。在37 ℃水浴中預(yù)孵育5 min， NADHP再生系統(tǒng)啟動反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min后取出，按“2.4”項下處理樣品，“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，每組平行做3份。

2.6 方法學(xué)考察 按照美國食品藥品監(jiān)督管理局方法學(xué)評價指導(dǎo)方針[8]，進(jìn)行專屬性、線性關(guān)系、回收率、精密度和穩(wěn)定性考察。

2.6.1 專屬性 分別取大鼠空白肝微粒體、空白肝微粒體+內(nèi)標(biāo)溶液、空白肝微粒體+標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)，按“2.4”項下處理樣品，“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，考察色譜峰分離與干擾情況。

2.6.2 線性關(guān)系 將2.00 mg·mL-1的咖啡因、美托洛爾、咪達(dá)唑侖儲備液，1.00 mg·mL-1的奧美拉唑儲備液，用甲醇稀釋成不同濃度的混合探針溶液，終濃度分別為咖啡因 1.91、3.75 、7.52 、15.04 、30.02 、37.59 、45.16 μmol·L-1，奧美拉唑0.64、1.24 、2.49 、4.98 、9.99 、12.56 、15.14 μmol·L-1，美托洛爾0.98 、1.96 、3.91 、7.81 、15.62 、19.52 、23.42 μmol·L-1，咪達(dá)唑侖0.74 、1.51 、3.02、6.00 、12.00 、16.49、18.00 μmol·L-1。將25 μL大鼠肝微粒體加入472.5 μL PBS緩沖液中，60 ℃加熱滅活，放置至室溫后分加入2.5 μL混合底物孵育體系，按“2.5”下孵育。每個樣本平行制備3份。

學(xué)術(shù)立場和觀點的分歧源于城市小區(qū)治理實踐的矛盾，而治理實踐的矛盾根源在于，隨著中國商品房制度改革以及由此帶來的城市小區(qū)居住空間結(jié)構(gòu)的變化、社會交往關(guān)系的變化、基于物權(quán)的權(quán)利關(guān)系及權(quán)利意識的變化等一系列現(xiàn)實和觀念的變化，國家對這些變化的認(rèn)識和制度調(diào)整卻相對滯后。對小區(qū)內(nèi)部出現(xiàn)的新的經(jīng)濟(jì)社會關(guān)系及其治理邏輯的辨識，有助于推動當(dāng)前城市小區(qū)治理走出困境。

2.6.3 精密度 取空白肝微粒體25 μL，加入472.5 μL PBS緩沖液，再分別加入2.5 μL 低、中、高濃度的混合探針標(biāo)準(zhǔn)液(咖啡因3.75、15.04、37.59 μmol·L-1，美托洛爾1.96、7.81、19.52 μmol·L-1，奧美拉唑1.24、4.98、12.56 μmol·L-1，咪達(dá)唑侖1.51、6.00、1.49 μmol·L-1)，其余按“2.4”項下方法操作后，于同日內(nèi)進(jìn)樣3次測定，求得日內(nèi)RSD；連續(xù)3日測定3次，求得日間RSD。

2.6.4 回收率 取空白肝微粒體 25 μL，加入472.5 μL PBS緩沖液，再分別加入2.5 μL按“2.6.3”項下方法制備的低、中、高濃度的混合探針標(biāo)準(zhǔn)液，其余按“2.4”項下處理進(jìn)樣后，記錄峰面積A1，再選取對應(yīng)濃度的對照品溶液進(jìn)樣，獲得峰面積 A2，計算絕對回收率(絕對回收率 = A1/A2 × 100 %)。用以求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計算出藥物濃度，與理論濃度相比較，計算相對回收率(相對濃度= 實測濃度/理論濃度 × 100 %)。

2.6.5 穩(wěn)定性 取空白肝微粒體 25 μL，加入472.5 μL PBS緩沖液后，再分別加入“2.6.3”項下低、中、高濃度樣品2.5 μL，每個質(zhì)量濃度6份樣品分析，分別于室溫放置6 h，-80 ℃冷凍放置2周，反復(fù)凍融3次條件下，按“2.4”項下處理樣品并測定。

2.7 陽性抑制劑抑制作用的研究 置冰浴，向已加入15 μL 大鼠肝微粒體(0.5 mg·mL-1)的PBS液中分別加入2.5 μL不同濃度的陽性抑制劑(α-萘黃銅，奎尼丁，氟康唑，酮康唑終濃度分別為：10、50、50、10 μmol·L-1)和2.5 μL混合探針溶液，以下操作同“2.4”項，空白組使用等體積甲醇溶液，每份平行做3份。

2.8 三種抗心血管病中成藥對大鼠肝微粒體的抑制作用 以各待測中成藥置換孵育體系中的陽性抑制劑，藥物組系列濃度為6.25、12.5、25、50、100、200 μg·mL-1，按“2.4”項下操作進(jìn)行孵育。由不同濃度反應(yīng)組底物剩余量來計算相應(yīng)酶抑制率：酶活性=(總底物濃度-剩余底物濃度)/ 總底物濃度。采用GraphPad Prism 5.0軟件線性回歸，將酶相對活性對待測藥物濃度對數(shù)值作圖，并計算各藥的半數(shù)抑制濃度( IC50)值。

3 結(jié)果

3.1.1 專屬性 各探針底物與大鼠肝微粒體共孵育30 min后的色譜圖如圖1(A)～(C)所示。咖啡因、美托洛爾、奧美拉唑、咪達(dá)唑侖和內(nèi)標(biāo)的相對保留時間分別為：8.006、9.205、10.216、11.678和19.120 min。結(jié)果表明在選定的色譜條件下，孵育體系中的其他物質(zhì)不干擾混合探針底物及內(nèi)標(biāo)的測定，各探針底物峰與內(nèi)標(biāo)物峰均良好分離，說明該方法具有良好的專屬性。

1.咖啡因;2.美托洛爾;3.奧美拉唑;4.咪達(dá)唑侖;5.地西泮圖1 空白肝微粒體(A)、空白肝微粒體+內(nèi)標(biāo)溶液(B)，空白肝微粒體+標(biāo)準(zhǔn)品+內(nèi)標(biāo)(C)的HPLC圖譜

3.1.2 線性關(guān)系 以探針底物濃度為橫坐標(biāo)，待測物的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在濃度范圍內(nèi)，各探針?biāo)幬锏幕貧w方程線性關(guān)系良好，表明該方法靈敏度好，在線性范圍內(nèi)測定樣品時準(zhǔn)確可靠。

表1 各探針?biāo)幬锏臉?biāo)準(zhǔn)曲線方程 (n=3)

3.1.3 精密度 4 種探針底物在肝微粒體中的日內(nèi)、日間精密度均RSD<10 %，精密度良好，結(jié)果見表2。

3.1.4 回收率 相對回收率范圍為(88.18±0.32)% ～(108.92±0.34)%，絕對回收率范圍為(75.85±6.09)% ～(93.37±1.40)%，符合檢測要求，結(jié)果見表2。

表2 各探針?biāo)幬锞芏群突厥章试囼灲Y(jié)果

3.1.5 穩(wěn)定性 肝微粒體樣品高、中、低濃度分別于室溫放置6h、-80℃反復(fù)凍融3次，長期凍存14 d，各探針穩(wěn)定性良好，符合生物樣品分析要求。

3.2 陽性抑制劑對CYPs的抑制作用 利用陽性抑制劑抑制 CYPs 亞酶的活性，見表4。加入陽性抑制劑后，各亞酶的代謝明顯減慢，表明 α-萘黃銅，奎尼丁，氟康唑，酮康唑分別對CYP1A2、P2D1、P2C11、P3A1活性有明顯抑制作用，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)，進(jìn)一步驗證檢測試驗方法的合理性。將陽性抑制劑的 IC50值與文獻(xiàn)比較[9]，符合文獻(xiàn)范圍，所用實驗體系滿足 CYPs 抑制活性評價的要求。

表3 陽性抑制劑對CYPs酶的抑制作用

表4 三種抗心血管中成藥的IC50值(μmol· L-1)

3.3 三種抗心血管疾病中成藥對CYPs的抑制作用 不同濃度藥物組對4種CYPs酶的抑制曲線如圖2 ～ 4所示。由圖可見，隨著各藥物濃度的增高，各亞酶活性呈明顯降低趨勢。由抑制曲線計算得到的 IC50值見表2。據(jù)通用CYPs酶抑制強度分級規(guī)則[10]：IC50<1 μmol·L-1為強抑制劑；1 μmol·L-1 10 μmol·L-1為弱抑制劑。因此，參松養(yǎng)心膠囊對CYP1A2、P3A1和芪藶強心膠囊對CYP2C11、P3A1 IC50值分別為：1.896、1.357 、1.513、6.669 μmol·L-1，均為中等抑制劑，；通脈養(yǎng)心丸對CYP2D1 IC50值為0.566 μmol·L-1，是其強抑制劑。參松養(yǎng)心膠囊對CYP2D1、P2C11，芪藶強心膠囊對CYP2D1、P1A2和通脈養(yǎng)心丸對CYP2C11、P3A1、P1A2的IC50值均大于10 μmol·L-1，抑制CYPs 的可能性較小，不易產(chǎn)生代謝性藥物相互作用。

圖2 SS對CYP各亞酶活性的抑制曲線圖

圖3 QL對CYP亞酶活性的抑制曲線圖

圖4 TM對CYP亞酶活性的抑制曲線圖

4 討論

CYPs作為一類重要的藥物代謝酶，參與75%的臨床藥物代謝，中藥制劑在體內(nèi)代謝酶作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化的同時對酶也會產(chǎn)生抑制或誘導(dǎo)作用，產(chǎn)生代謝性相互作用[10]。對 CYPs的抑制作用所致的藥物相互作用(約占全部相互作用的70%)的臨床意義遠(yuǎn)大于誘導(dǎo)作用(23%)[11]。“Cocktail” 探針?biāo)幬锓ㄖ敢环N為獲取多個代謝酶的表型信息，首先同時給予多種相對低劑量的探針?biāo)幬铮缓鬁y定生物樣本中各探針?biāo)幬锏拇x率或者其他代謝分型指標(biāo)的方法，具有快速、高效、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢[12]。筆者通過“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄔu價參松養(yǎng)心膠囊、芪藶強心膠囊和通脈養(yǎng)心丸對肝微粒體中CYPs各亞酶活性的影響，從而預(yù)測藥物相互作用，提供臨床用藥參考。根據(jù)文獻(xiàn)[10]，可知參松養(yǎng)心膠囊對CYP1A2、P3A1和芪藶強心膠囊對CYP2C11、P3A1均有中度抑制作用；通脈養(yǎng)心丸對CYP2D1有強抑制作用。藥物對CYP1A2、CYP2C11和CYP3A1酶的抑制作用，將使酶活性相應(yīng)降低，可能會導(dǎo)致經(jīng)上述亞酶代謝的其他藥物代謝減慢，血藥濃度升高或體內(nèi)藥物蓄積，作用時間相對延長，臨床上應(yīng)謹(jǐn)慎合用。中藥作用是由多種有效成分的有機(jī)結(jié)合，與多種疾病相關(guān)靶點綜合影響而產(chǎn)生的兩個復(fù)雜體系之間的相互作用[13]。有文獻(xiàn)[14-15]報道，參松養(yǎng)心膠囊的主組分酸棗仁的水提液，山茱萸、桑寄生等的主要活性成分沒食子酸能抑制CYP3A活性。芪藶強心膠囊組分黃芪的主要活性成分胡椒苷II對人CYP2C16活性有抑制作用，且組分中的人參的主要藥效物質(zhì)人參總皂苷能夠下調(diào)人CYP3A4酶活性，延長藥物作用時間[16-17]。參松養(yǎng)心膠囊和芪藶強心膠囊均含有丹參成分， Wang等[18]研究表明丹參醇提物顯著抑制人及大鼠肝微粒CYP1A2活性，還抑制人肝微粒CYP3A4和大鼠肝微粒CYP3A1酶活性。通脈養(yǎng)心丸中甘草的有效成分甘草酸(甘草甜素)、甘草次酸、甘草苷、甘草素等均能抑制CYP2D1的活性[19-20]。這些研究結(jié)果與本實驗結(jié)果不矛盾。因此，參松養(yǎng)心膠囊、芪藶強心膠囊和通脈養(yǎng)心丸對CYPs亞酶的抑制作用可能與其主組分的活性成分有關(guān)。

本次研究，三藥直接作用于大鼠肝微粒體，與傳統(tǒng)給藥途徑差異較大，且中藥成分復(fù)雜，口服給藥吸收后對肝微粒體CYPs亞酶活性的影響與體外實驗差異較大，體外研究或動物研究不能完全代替人的體內(nèi)研究，因此三藥是否在臨床應(yīng)用時產(chǎn)生抑制作用還需進(jìn)行人肝微粒體或人體合并用藥進(jìn)一步驗證。