小建中膠囊微生物限度檢查方法學研究

劉艷平，張秀花，劉靖華

（山東省菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤274000）

小建中膠囊由桂枝、白芍、炙甘草、生姜、大棗等5味中藥經現代工藝精制而成，具有溫中祛寒、緩急止痛功效［1］。標準制法中桂枝以水蒸氣蒸餾提取揮發油入藥，具有明顯的抗菌活性［2－5］，配方中白芍、生姜等亦具有一定抑菌作用［6－10］，進行微生物限度檢查時，需首先消除樣品本身的抑菌作用，才能使被檢微生物正常繁殖［11］。本研究中采用3批樣品進行方法適用性試驗，建立了小建中膠囊的微生物限度檢查方法。現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

1.1 儀器

HZT－A600型電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；MLS－3781L－PC型高壓蒸汽滅菌器（三洋工業株式會社）；ClassⅡBSC型生物安全柜（新加坡ESCD公司）；WGZ－2XJ型細菌濁度分析儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）；DHP－420型電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器廠）；SPX－150B型生化培養箱（上海博泰實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

小建中膠囊（貴州太和制藥有限公司，批號分別為20190801，20200501，20200301）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號為190518），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號為190712），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號為190625），pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號為190206），均購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均購自廣東環凱微生物科技有限公司，試驗所用菌株均為第3代。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

菌液：取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成菌落數不大于1×104cfu／mL的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養物，再用含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成菌落數不大于1×104cfu／mL的菌懸液；取大腸埃希菌，用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成菌落數不大于100 cfu／mL的菌懸液［12］。

供試品溶液：取樣品內容物10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液溶解并稀釋至100 mL，混勻，制成1∶10（m／V）供試品溶液；用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成1∶20（m／V），1∶50（m／V），1∶80（m／V）的系列供試品溶液［13］。

2.2 微生物檢查常規法

試驗組：取2.1項下1∶10的供試品溶液適量，分別置5支無菌試管，每管9.9 mL，分別加入2.1項下5種菌懸液0.1 mL，混勻，各取1 mL注入平皿，平行2份。

空白對照組：取2.1項下1∶10的供試品溶液適量，置無菌管，每管9.9 mL，分別加入試驗組對應的稀釋液0.1 mL，混勻，各取1 mL注入平皿，平行2份。

菌液對照組：取試驗組對應的稀釋液分裝于無菌試管中，每管9.9 mL，分別加入2.1項下5種菌懸液0.1 mL，混勻，各取1 mL注入平皿，平行2份。

試驗菌加樣回收測定：取上述3組平皿，需氧菌計數中，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌在32～33℃條件下用TSA培養72 h；白色念珠菌、黑曲霉在33～35℃條件下用TSA培養5 d；霉菌酵母菌計數中，白色念珠菌、黑曲霉在23～25℃條件下用SDA培養5 d［12］。按公式計算回收比，回收比＝（試驗組菌落數－空白對照組菌落數）／菌液對照組菌落數。結果需氧菌計數中，銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌回收比均小于0.5，詳見表1（表中“銅綠”為銅綠假單胞菌，“枯草”為枯草芽孢桿菌，“金葡”為金黃色葡萄球菌，“白念”為白色念珠菌，表2、表4同）。可見，常規法不能消除樣品中抑菌成分，需進一步試驗。

表1 常規法試驗菌株回收比（n＝3）Tab.1 Recovery ratio of test strains by the routine method（n＝3）

2.3 微生物檢查稀釋法

試驗組：取2.1項下1∶20（m／V）的供試品溶液，分別置2支無菌試管中，每管9.9 mL，分別加入2.1項下銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌2種菌懸液0.1 mL，混勻，各取1 mL注入平皿，平行制備2份。同法制備1∶50（m／V），1∶80（m／V）溶液。

供試品對照組：取2.1項下1∶20（m／V）的供試品溶液9.9 mL，置無菌試管中，加入pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，取1 mL注入平皿，平行制備2份。同法制備1∶50（m／V）和1∶80（m／V）供試品。

菌液對照組：同常規法“菌液對照組”項下方法制備銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌2種菌液對照組。同法制備1∶50（m／V）和1∶80（m／V）菌液。

試驗菌加樣回收測定：按2.2項下方法操作。1∶20供試液，1批樣品銅綠假單胞菌、3批樣品枯草芽孢桿菌回收比均小于0.5；1∶50供試液，2批樣品枯草芽孢桿菌回收比均小于0.5；1∶80供試液，3批樣品2種菌株回收比均在0.5～2.0范圍內，符合藥典要求。詳見表2。

表2 稀釋法試驗菌株回收比（n＝3）Tab.2 Recovery ratio of test strains by the dilution method（n＝3）

2.4 控制菌檢查

供試品組（A組）：取2.1項下1∶10（m／V）供試品溶液3份，每份10 mL，分別置100，150，200 mL TSB中。

陽性對照組（B組）：取2.1項下1∶10（m／V）供試品溶液3份，每份10 mL，分別置100，150，200 mL TSB中，分別加入2.1項下大腸埃希菌菌液1 mL。

陰性對照組（C組）：以稀釋液代替供試品溶液，其余同A組。

控制菌檢查：上述3組均在33～35℃條件下培養24 h［14］。結果B組均檢出陽性菌，說明小建中膠囊對大腸埃希菌無抑制作用。詳見表3。

表3 不同培養基體積控制菌檢查結果（n＝3）Tab.3 Results of control bacteria test in different medium volume（n＝3）

2.5 微生物限度檢查法適用性驗證

對樣品進行微生物限度檢查法適用性驗證。結果，微生物計數采用1∶80供試品溶液，3批樣品5種菌株回收比均在0.5～2.0范圍內；控制菌檢查采用常規法，陽性對照組檢出陽性菌，符合藥典要求。詳見表4。

表4 微生物限度檢查法適用性驗證試驗結果（平均回收比）Tab.4 Results of applicability verification test of microbial limit test method（average recovery ratio）

3 討論

藥品微生物限度檢查是藥品管理體系中的一個重要環節，藥品受微生物污染程度直接反映藥品生產、運輸、銷售、貯藏等環節的質量管理是否規范。對藥品中污染的微生物進行控制，建立適宜的藥品微生物限度檢查方法，可最大限度地保證公眾用藥安全有效。微生物菌落總數回收比應在0.5～2.0之間，回收比小于0.5時，可采用稀釋法，加入適宜的中和劑或滅活劑，薄膜過濾法，以及聯合應用上述方法可消除供試品的抑菌活性。微生物限度檢查方法建立的關鍵點是采用何種技術手段消除樣品中的抑菌成分，且操作方法科學、簡便、快速。

本研究中的樣品有明顯抑菌作用，將常規法回收比小于0.5的銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌作為敏感菌株，采用稀釋法、1∶80供試液，各試驗菌回收比均在0.5～2.0之間，符合藥典要求，故可用于小建中膠囊微生物計數檢查。采用常規法和稀釋法同時進行大腸埃希菌檢查，結果表明，小建中膠囊對大腸埃希菌無抑制作用，常規法可用于其控制菌的檢查。

本研究中根據制劑的抑菌特性，采用稀釋法對需氧菌、霉菌酵母菌及常規法對大腸埃希菌進行驗證，方法可行、結果可靠，可用于該產品微生物限度檢查的質量控制，同時為藥監部門科學監管提供一定的技術參考。