高效液相色譜法同時測定沉香化滯丸中10種成分含量

安艷蘇，許 慶，畢秋左

（云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖655000）

沉香化滯丸是非處方藥，由沉香、牽牛子、枳實、五靈脂、山楂、枳殼、陳皮、香附、厚樸、莪術、砂仁、大黃等15味中藥組方，有理氣化滯功效，可用于治療飲食停滯、胸腹脹滿等證［1］。其現行標準中僅有理化鑒別項，在質量控制中稍顯不足。陳皮、枳殼、厚樸、大黃為方中主藥，含有蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等10種成分［1－5］，基于中藥成方的復雜性，中成藥質量控制的特點，要求采用綜合量化的手段控制其質量的穩定性和有效性。本研究中采用高效液相色譜法同時測定沉香化滯丸中上述10種成分的含量［3－8］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括G7111A型四元泵、G7129A型自動進樣器及柱溫箱、G7115A型紫外檢測器（美國Agilent公司）；MS205DU型電子分析天平（梅特勒托利多儀器＜上海＞有限公司）；KQ－300UDB型雙頻數控超聲清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

沉香化滯丸（陜西漢王藥業股份有限公司，批號為002805，002802；河南潤紅本草制藥有限公司，批號為190904；安陽路德藥業有限公司，批號為180608）；蕓香柚皮苷對照品（北京壇墨質檢科技有限公司，批號為20170304，含量為99.2%）；柚皮苷對照品（批號為110722－201613，含量為94.3%），新橙皮苷對照品（批號為111857－201703，含量為99.2%），蘆薈大黃素對照品（批號為110795－201609，含量為98.1%），大黃酸對照品（批號為110757－201607，含量為99.3%），大黃素對照品（批號為110756－201512，含量為98.7%），和厚樸酚對照品（批號為110730－201614，含量為99.3%），厚樸酚對照品（批號為110729－201513，含量為98.8%），大黃酚對照品（批號為110796－201621，含量為99.2%），大黃素甲醚對照品（批號為110758－201415，含量為99.1%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min時80%A，10～25 min時80%A→60%A，25～40 min時60%A，40～55 min時60%A→35%A，55～70 min時35%A，70～70.5 min時35%A→80%A，70.5～75 min時80%A）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品貯備液Ⅰ：分別取蘆薈大黃素對照品15.30 mg，大黃酸對照品10.08 mg，精密稱定，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容；精密量取5 mL，置已有大黃素對照品10.64 mg、大黃素甲醚對照品10.93 mg的25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得。

混合對照品貯備液Ⅱ：取和厚樸酚對照品17.48 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容；精密量取5 mL，置已有厚樸酚對照品13.64 mg，大黃酚對照品12.43 mg的10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得。

混合對照品貯備液Ⅲ：取柚皮苷16.36 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容；精密量取5 mL，置已有蕓香柚皮苷對照品10.40 mg，新橙皮苷10.11 mg的10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得。

混合對照品溶液：取混合對照品貯備液Ⅰ和Ⅱ各0.2 mL，混合對照品貯備液3 0.5 mL，置同一5 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得蕓香柚皮苷（103.17 μg／mL）、柚皮苷（77.14 μg／mL）、新橙皮苷（100.29 μg／mL）、蘆薈大黃素（12.01 μg／mL）、大黃酸（8.01 μg／mL）、大黃素（16.80 μg／mL）、和厚樸酚（34.72 μg／mL）、厚樸酚（53.91 μg／mL）、大黃酚（49.32 μg／mL）、大黃素甲醚（17.33 μg／mL）的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品適量，研細，精密稱取1.25 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL，超聲（功率240 W，頻率45 kHz，下同）處理40 min，放至室溫，用甲醇定容，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按沉香化滯丸處方和工藝分別制備缺陳皮和枳殼、缺厚樸、缺大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性及專屬性試驗：取2.2項下溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。理論板數按蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、厚樸酚、大黃酚、大黃素甲醚峰計分別為11 573，12 426，51 684，96 019，73 385，392 110，628 638，755 833，308 090，203 228；10個成分均分離完全，基線分離良好；陰性對照品溶液色譜圖中，在與混合對照品溶液色譜相應保留時間處無干擾峰，專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.narirutin 2.naringin 3.neohesperidin 4.aloe－emodin 5.rhein 6.emodin 7.honokiol 8.magnolol 9.chrysophanol 10.physcion A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution without Aurantii Fructus and Pericarpium Citri Reticulatae D.Negative reference solution without Rhei Radix et Rhizoma E.Negative reference solution without Magnoliae Officinalis CortexFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品溶液適量，加流動相制成系列混合對照品溶液。取10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，其回歸方程及線性關系見表1。

表1 方法學考察結果Tab.1 Results of the methodological investigations

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果見表1，可見儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果見表1，可見供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為002805）適量，精密稱定，各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果見表1，可見方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為002805）適量，共6份，分別加2.2項下混合對照品貯備液Ⅲ1.0 mL，混合對照品貯備液Ⅰ和Ⅱ各0.5 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

取各批樣品適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg／g，n＝3）Tab.2 Content determination of 10 components in the samples（mg／g，n＝3）

3 討論

樣品提取條件優化［5－6］：預試驗中分別選擇超聲、回流、索氏提取3種方法進行考察［8－9］，結果表明，超聲提取效率最高，且簡便快捷，故試驗選用超聲提取法制備供試品溶液。并比較了超聲提取20，30，40，60，90 min的效果，結果顯示超聲提取40，60，90 min時的結果一致，故以40 min為提取時間。對提取溶劑（甲醇、乙醇、稀乙醇）進行優化，發現甲醇提取后，各成分總含量優于乙醇和稀乙醇提取，且雜質明顯少于乙醇提取，故以甲醇為提取溶劑。

檢測波長選擇［5］：由于樣品組方藥物較多，化學成分復雜且多樣，本研究中一次檢測就可控制樣品中陳皮、枳殼、厚樸、大黃4味藥材的質量。以DAD掃描結果，結合色譜峰及峰強度，對200～400 nm波長范圍內的色譜進行分析。結果，在254 nm波長處色譜峰個數和峰強度均較理想，故被選作檢測波長。

流動相考察：預試驗中對不同流動相的組成比例進行考察［7－16］，采用不同比例的甲醇－水、乙腈－水、甲醇－磷酸溶液、乙腈－磷酸溶液作為流動相，發現在流動相中加入一定比例的酸有助于提高待測成分與雜質峰間的分離度，且峰形好，進一步考察，確定以乙腈－0.1%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，可獲得較理想的色譜圖。

綜上所述，本試驗中建立了高效液相色譜法同時測定沉香化滯丸中蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚含量。該方法前處理條件簡便、快捷，所建立的梯度洗脫方法靈敏、準確，測定結果穩定可靠，重復性好，適用性強，實現了多成分控制沉香化滯丸的質量。