快速溶劑萃取－超高效液相色譜法測定羅漢果中羅漢果皂苷V含量

黃林杰

（廣西壯族自治區梧州市食品藥品檢驗所，廣西 梧州543002）

羅漢果為葫蘆科多年生藤本植物羅漢果Siraitia grosuenorii（Swingle）C.Jeffreyelx A.M.Lu et Z.Y.Zhang的干燥果實，味甘、酸，性涼，可用于治療肺熱燥咳、咽痛失音、腸燥便秘等癥［1］，主產于桂林市臨桂區和永福縣的山區，為廣西名貴特產中藥，藥食兩用。羅漢果營養價值豐富，多用于泡茶飲用，也可作為煲湯時的配料，羅漢果皂苷Ⅴ是其主要甜味成分，甜度超過蔗糖的300倍，但糖尿病患者也可食用［2］，其含量是評價藥材質量的重要指標［3］。2020年版《中國藥典（一部）》中采用羅漢果皂苷Ⅴ作為指標性成分對羅漢果進行鑒別和質量控制，但所用提取方法為回流提取，操作較繁雜，耗時較長，溶劑用量較大。快速溶劑萃取法是指在密閉容器內，于高溫、高壓條件下，在短時間內用有機溶劑提取固體或半固體樣品的前處理方法［4］。與超聲、回流、超臨界萃取等方法相比，其具有萃取溶劑用量少、提取時間短、萃取效率高、操作簡便、自動化程度高等優點［5］。本研究中采用快速溶劑萃取法提取羅漢果藥材有效成分，并采用超高效液相色譜法對其含量進行測定。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XA205DU型電子分析天平（德國Mettler Toledo公司）；ASE350型快速溶劑萃取儀、U3000型超快速液相色譜儀，均購自美國Thermo公司；Milli－Q Integral型水純化系統（德國Merck公司）。

1.2 試藥

羅漢果皂苷V對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111754－201502，含量＞98%）；羅漢果藥材（批號分別為1910180，1908166，190723，產地均為廣西），購于廣西壯族自治區梧州市和玉林市藥材市場，經筆者鑒定為正品；乙腈為色譜純，甲醇、乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18柱（100 mm×3.0 mm，3μm）；流動相：乙腈－水（23∶77，V／V）；流速：0.5mL／min；檢測波長：203 nm；柱溫：40℃；進樣量：2 μL。

2.2 溶液制備

取羅漢果皂苷V對照品22.01 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為0.880 4 mg／mL的對照品溶液。取藥材樣品粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，與適量硅藻土混合均勻得樣品1，待用；在預先放好過濾膜的10 mL萃取池中先加入3 g硅膠，后加入混合均勻的樣品1，再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線上，擰緊萃取池上蓋；快速溶劑萃取條件，溫度100℃，壓力1 500 psi，甲醇靜態萃取5 min，循環1次；萃取結束后，將萃取液移至25 mL容量瓶中，加甲醇定容，濾過，取上清液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2項下2種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果。理論板數按羅漢果皂苷V峰計應不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 超高效液相色譜圖1.mogrosideⅤA.Reference solution B.Test solutionFig.1 UPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2項下對照品溶液適量，加液動相分別制成質量濃度為4.402，44.02，88.04，220.1，352.16，440.2 μg／mL的系列對照品溶液。量取2 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以羅漢果皂苷V質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝1 679.460 8X－2.348 1，r＝0.999 98（n＝6）。結果表明，羅漢果皂苷V質量濃度在4.402～440.2 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果的RSD為1.51%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，1，3，6，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.62%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為1910180）適量，精密稱定，各6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果羅漢果皂苷V平均含量為1.01%，RSD分別為1.50%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為1910180）適量，共9份，分別加入低、中、高質量濃度的羅漢果皂苷V對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取3批藥材樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（%，n＝2）Tab.2 Content determination of mogrosideⅤin the samples（%，n＝2）

3 討論

3.1 測定方法選擇

參考文獻［6－12］，流動相均為乙腈－水，乙腈的比例在20%～23%之間，色譜柱均為250 mm的長柱，分析時間較長，洗脫能力差，保留時間基本為20 min，最短13 min。本研究中選擇流動相為乙腈－水（23∶77，V／V），使用100 mm的短柱，采用超高效液相色譜儀［13］進行檢測，由于超高效液相色譜法具有分析速度快、分離度好的特點，主成分不到6 min即出峰。

3.2 提取方法比較

回流提取法與快速溶劑萃取法所得成分含量相當，但前者操作煩瑣，總時長要4～5 h；后者過程操作簡單，自動化程度高，提取效率好，整個提取過程短于15 min，降低了運行成本，提高了工作效率。

3.3 提取因素考察

提取溶劑及萃取池：預試驗中分別將藥材樣品粉末用甲醇、乙醇、乙腈作為提取溶劑進行提取，并比較結果。結果顯示，在相同條件下，提取效率甲醇＞乙醇＞乙腈，故以甲醇作為提取溶劑。其他條件不變，選擇10 mL和5 mL萃取池同步考察，結果后者提取效果低于前者，考慮原因為溶劑沖洗體積有限，提取不充分。

提取時間：預試驗中，將藥材樣品粉末于100℃下分別用甲醇提取3，5，8 min，提取1次。結果顯示，在5 min時提取效果最好，隨著提取時間的延長，提取效果無明顯增加，其原因可能是羅漢果皂苷V在5 min時已提取完全，故選擇提取時間為5 min。

提取溫度：甲醇的沸點約為64℃，結合快速溶液萃取劑的高壓穿透性，選擇80，100，120℃對提取方法進行考察。結果顯示，溫度對提取效率的影響較大，在考慮提取效率的同時，還應考慮高溫對成分降解的影響及所使用溶劑的熔沸點。100℃和120℃效果最好，且2種條件下含量幾乎相等，故采用100℃作為萃取溫度。

提取次數：將藥材樣品粉末在100℃下用甲醇提取5 min，分別提取1，2，3次。結果顯示，萃取1次即可達到較好的萃取率，故選擇萃取1次。

凈化劑：羅漢果中富含多糖類成分［14］，考慮到糖類成分雜質較多［15］，分別使用了N－丙基乙二胺（PSA）、氧化鋁（中性、酸性、堿性）、硅膠作為凈化劑對樣品進行凈化。結果3種氧化鋁均會降低羅漢果皂苷V的含量。PSA和硅膠均對羅漢果皂苷V的含量無影響，凈化效果較好，結合試驗成本的考慮，最終采用硅膠作為凈化劑。經過對硅膠用量的考察，添加3 g和4 g的效果類似，且比1 g和2 g的略優，故選擇3 g硅膠。

綜上所述，本研究中建立的方法簡便、快捷、準確、重復性好，可用于測定羅漢果中羅漢果皂苷V的含量。