基于UHPLC－Q－Exactive Orbitrap MS技術(shù)的血藤果化學(xué)成分分析*

熊 佩，李凱琳，龔開妍，史思林，彭 婕，吳衛(wèi)華，2，3△，蔡 偉，2，3

（1.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南 懷化418000；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化418000；3.湖南醫(yī)藥學(xué)院新型抗體藥物及其智能運(yùn)輸系統(tǒng)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化418000）

血藤果為木蘭科植物厚葉五味子Kadsura coccinea（Lem）A.C.Smith的干燥成熟果實(shí)［1］，又名冷飯團(tuán)、布福娜、香繡球、福星果、足球果［2］，是集食用、藥用、綠化、觀賞于一體的多用途水果，開發(fā)潛力較大。其多生于江西、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地，秋末冬初果實(shí)成熟后采收，干燥或鮮用，具有祛風(fēng)活絡(luò)、調(diào)經(jīng)止痛、益腎固精、補(bǔ)血養(yǎng)顏等功效，常用于婦女圍絕經(jīng)期綜合征、產(chǎn)后出血、婦女不孕［1］。現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)黑老虎的研究多集中于根莖部，發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分主要包括木質(zhì)素類和三萜類，以及單萜類、倍半萜類、甾體類、氨基酸等［3］。血藤果作為黑老虎的果實(shí)，僅有少量文獻(xiàn)通過系統(tǒng)預(yù)算法對(duì)其可能的化學(xué)成分進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，僅能初步判定其可能的化學(xué)成分［4］。本試驗(yàn)中采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿軌道阱質(zhì)譜（UHPLC－Q－Exactive Orbitrap MS）技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜快速高效的分離能力與質(zhì)譜高特異性、高靈敏度的分析能力，同時(shí)根據(jù)各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)圖譜，各色譜峰的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)，對(duì)血藤果的化學(xué)成分進(jìn)行快速分析、鑒定，為血藤果的后續(xù)開發(fā)提供基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Q－Exactive型四極桿－靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Dionex UltiMate3000型高效液相色譜儀（美國Dionex公司），DJB1200型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；KQ－300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

檸康酸（批號(hào)為GE6650000），酒石酸（批號(hào)為2018042074），對(duì)羥基苯甲醛（批號(hào)為DH1925000），順式烏頭酸（批號(hào)為20190512），均購自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，含量均大于98%；奎寧酸（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為A06N11L130218，含量＞98%）；檸檬酸（批號(hào)為C108869），L－（－）－蘋果酸（批號(hào)為M105695），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量均大于98%；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜級(jí)／質(zhì)譜級(jí)；水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；血藤果藥材采自湖南省懷化市通道縣，經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院蔡偉副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Scientific Hypersil GOLDTMaQ柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）－0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min時(shí)100%A，2～5 min時(shí)100%A→98%A，5～20 min時(shí)98%A→85%A）；流速為0.3 mL／min；進(jìn)樣量為1 μL；柱溫為40℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式下噴霧電壓為3.5 kV，鞘氣壓力為35 arb，輔助氣壓力為10 arb，離子傳送管溫度為320℃，干燥氣溫度為350℃，S－lens RF level為60，分辨率為35 000，掃描范圍為m／z100～800；負(fù)離子模式下噴霧電壓為3.2 kV，鞘氣壓力為35arb，輔助氣壓力為10arb，離子傳送管溫度為320℃，干燥氣溫度為350℃，S－lens RF level為60，分辨率為35 000，掃描范圍為m／z100～800。

2.2 溶液制備

分別取檸康酸、酒石酸、檸檬酸、L－（－）－蘋果酸、奎寧酸、對(duì)羥基苯甲醛、順式烏頭酸對(duì)照品適量，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，制成單一對(duì)照品貯備液；按一定比例混合，即得混合對(duì)照品溶液。稱取冷凍干燥后的藥材樣品1.0 g，精密稱定，置50 mL錐形瓶中，加入50%甲醇10 mL，超聲（功率為800 W，頻率為40 kHz）提取1 h，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。50%甲醇經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 成分分析

2.3.1 篩選

在正離子掃描模式下篩選出28個(gè)化學(xué)成分，在負(fù)離子掃描模式下篩選出25個(gè)成分，共51個(gè)化學(xué)成分，其中43個(gè)化學(xué)成分為首次從血藤果中鑒定得到。各化學(xué)成分的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比的實(shí)測值與理論值、二級(jí)碎片離子信息見表1［5－18］，其正、負(fù)離子掃描模式下高分辨提取離子流圖見圖1，UHPLC－Q－Exactive Orbitrap MS技術(shù)首次鑒定到的血藤果中43個(gè)化學(xué)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 血藤果藥材中首次鑒定到的43個(gè)化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structures of 43 constituents identified from Kadsura Coccinea Fructus for the first time

表1 血藤果藥材中化學(xué)成分信息Tab.1 Identification of chemical constituents in Kadsura Coccinea Fructus

2.3.2 正負(fù)離子模式下同時(shí)鑒定

化合物3、化合物7在正負(fù)離子模式下均被檢測出，結(jié)合文獻(xiàn)［5］報(bào)道，分別鑒定為天冬酰胺、谷氨酸。

2.3.3 正離子模式下鑒定

正離子模式下，峰30、峰38的保留時(shí)間不同而準(zhǔn)離子峰相同，通過與檸康酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜行為進(jìn)行對(duì)比確認(rèn)，鑒定為對(duì)羥基苯甲醛的同分異構(gòu)體。

峰2、峰19的保留時(shí)間不同而準(zhǔn)離子峰及二級(jí)碎片離子相同，結(jié)合文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道，分別鑒定為D－精氨酸、L－精氨酸。

峰5、峰18的保留時(shí)間不同而準(zhǔn)離子峰及二級(jí)碎片離子相同，其中碎片離子m／z110.071 5［M＋HH2O－CO］－是通過失去1個(gè)CO2和1個(gè)H2O所得，結(jié)合文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道，分別鑒定為D－組氨酸、L－組氨酸。

峰14和峰26保留時(shí)間不同但均產(chǎn)生準(zhǔn)離子峰144.101 8［M＋H］＋及碎片離子m／z98.096，結(jié)合文獻(xiàn)［9］報(bào)道內(nèi)容，分別鑒定為水蘇堿及其同分異構(gòu)體。

峰15與峰25的保留時(shí)間不同但均產(chǎn)生相同準(zhǔn)離子峰，得到相同二級(jí)碎片離子m／z80.050 0，結(jié)合文獻(xiàn)［8］報(bào)道，分別鑒定為煙酸及其同分異構(gòu)體。

峰16與峰28的保留時(shí)間不同但均產(chǎn)生相同準(zhǔn)離子峰，并通過失去1個(gè)NH3得到碎片離子119.049 2［M＋H－NH3］＋，結(jié)合文獻(xiàn)［10］報(bào)道，鑒定為腺嘌呤的同分異構(gòu)體。

峰31、峰39保留時(shí)間不同但均產(chǎn)生相同準(zhǔn)離子峰，得到二級(jí)碎片離子，其中碎片離子m／z136.075 6［M＋H－CO－H2O］＋是通過失去1個(gè)CO和1個(gè)H2O所得，結(jié)合文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道，分別鑒定為D－酪氨酸、L－酪氨酸。

峰32、峰40的保留時(shí)間不同但均得到相同準(zhǔn)離子峰及二級(jí)碎片離子m／z123.044 1，結(jié)合文獻(xiàn)［11］報(bào)道，鑒定為2－羥基肉桂酸。

峰37、峰41的保留時(shí)間不同但均得到相同準(zhǔn)離子峰，并通過失去1個(gè)CO和1個(gè)H2O得到碎片離子m／z86.096 9［M＋H－CO－H2O］＋，結(jié)合文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道，分別鑒定為D－亮氨酸、L－亮氨酸。

峰48、峰50和峰51的保留時(shí)間不同但均產(chǎn)生相同準(zhǔn)離子峰及二級(jí)碎片離子m／z117.070 0，結(jié)合文獻(xiàn)［13］報(bào)道，鑒定為萘胺的同分異構(gòu)體。

2.3.4 負(fù)離子模式下鑒定

負(fù)離子模式下，峰9、峰21、峰34的保留時(shí)間不同但準(zhǔn)離子峰相同，通過與檸康酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜行為對(duì)比，分別鑒定為檸康酸同分異構(gòu)體。

續(xù)表1血藤果藥材中化學(xué)成分信息Continued Tab.1 Identification of chemical constituents in the Kadsura Coccinea Fructus

圖1提取離子流圖A.A′.Under the positive ion scanning mode B，B′.Under the negative ion scanning modeFig.1 Extraction ion flow diagram

峰10、峰33的保留時(shí)間、碎片信息及特征峰分別與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品一致，故準(zhǔn)確鑒定為酒石酸、順式烏頭酸；峰17的準(zhǔn)離子峰m／z與二級(jí)質(zhì)譜信息與峰33一致，鑒定為反式烏頭酸。

峰11的保留時(shí)間、碎片信息及特征峰與奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，鑒定為奎寧酸；峰22的準(zhǔn)離子峰m／z與二級(jí)質(zhì)譜信息與峰11一致，鑒定為奎寧酸的同分異構(gòu)體。

峰12的保留時(shí)間、碎片信息及特征峰與L－（－）－蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，故準(zhǔn)確鑒定為L－（－）－蘋果酸；峰23的準(zhǔn)離子峰m／z與二級(jí)質(zhì)譜信息與峰12一致，故鑒定為D－（＋）－蘋果酸。

峰20的保留時(shí)間、碎片信息及特征峰與檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，準(zhǔn)確鑒定為檸檬酸；峰29的準(zhǔn)離子峰m／z與二級(jí)質(zhì)譜信息與峰20一致，故鑒定為檸檬酸同分異構(gòu)體。

峰43、峰44的保留時(shí)間不同但得到相同的準(zhǔn)離子峰及二級(jí)碎片離子m／z147.044 2，72.007 8，結(jié)合文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道，推測其分別為D－苯丙氨酸、L－苯丙氨酸。

3 討論

本試驗(yàn)中采用UHPLC－Q－Exactive Orbitrap MS技術(shù)，分別在正、負(fù)離子掃描模式下首次對(duì)血藤果藥材的成分進(jìn)行研究，共鑒定出絲氨酸、L－精氨酸、天冬酰胺、谷氨酸等氨基酸類成分15個(gè)，檸檬酸、酒石酸、奎寧酸、莽草酸等有機(jī)酸類成分21個(gè)，生物堿、核苷等其他類成分15個(gè)。血藤果藥材富含多種營養(yǎng)成分及較高藥用價(jià)值，包含多種人體所需氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸為功能性氨基酸［19］，具有預(yù)防心血管疾病和調(diào)節(jié)免疫等作用，精氨酸與組氨酸為兒童生長發(fā)育密切相關(guān)的半必需氨基酸［20］。酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等有機(jī)酸具有抗菌和抗氧化作用［21－22］。此外，腺嘌呤具有舒張支氣管平滑肌、抑制氣道炎癥、調(diào)節(jié)免疫作用［23］，尿苷、鳥嘌呤核苷具有抗腫瘤、抗病毒、肝損傷修復(fù)等作用［24］。本研究中所建立的方法可高效、快捷地鑒定血藤果藥材中的化學(xué)成分，為后續(xù)其藥效物質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為更全面地開發(fā)利用血藤果的藥食兩用產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。