大黃素對急性肺損傷模型大鼠的保護作用*

朱麗華，王，彭信言，章忠明△，李激文

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧530021；2.廣西壯族自治區柳州市工人醫院急診科，廣西 柳州545005）

急性肺損傷（ALI）是以肺泡－毛細血管壁損傷、肺水腫和炎性細胞募集為特征的綜合征，表現為肺內皮細胞被破壞，肺毛細血管的高通透性和臨床肺水腫［1］。水通道蛋白（AQP）屬膜水運輸蛋白，AQP4為其中通透性最強的蛋白［2］，在肺、胃腸器官和腎臟的星形膠質細胞、骨骼肌和上皮細胞的足突中均有表達［3］。核因子（NF）－κB在炎癥調節中起重要作用，而炎性反應在ALI的發生、發展中起關鍵性作用［4］。大黃素存在于各種中草藥，有抗腫瘤、抗炎等多種作用［5］。本研究中探討了大黃素對急性肺損傷模型大鼠肺組織中炎性細胞因子、AQP4和NF－κB表達水平的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：CKX53型倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）；MK－3型全自動酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；GEMPremier300型全自動血氣分析儀（美國Jinkou公司）。

試藥：大黃素（上海吉至生化科技有限公司，批號為518－82－1）；蘇木素－伊紅（HE）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號為AR1180）；白細胞介素試劑盒（IL－1β，IL－6，北京百奧萊博科技有限公司，批號分別為ARB12155，ZN2880－GPK）；腫瘤壞死因子－α（TNF－α）試劑盒（武漢亞科因生物科技有限公司，批號為AbbkineKET9007）；RIPA裂解液及BCA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為R0020，PC0020）；AQP4抗體、p－NF－κBp65抗體、NF－κBp65抗體、GAPDH抗體和IgG－HRP抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號分別為59678S，3033S，8242S，5174S，7074S）。

動物：SPF級SD大鼠40只（廣西醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK桂2020－0003），雄性，8～10周齡，體質量（180±20）g，飼養于標準動物房（使用許可證號：SYXK桂2020－004），自由獲取食物和水。適應環境1周后，進行后續實驗。

1.2 方法

將40只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、大黃素低劑量組和大黃素高劑量組，各10只。除對照組外，另3組大鼠經尾靜脈注射油酸（0.1 mL／kg）溶液以復制急性肺損傷模型。12 h后，從大鼠尾動脈抽取0.2 mL血液監測氧合指數（PaO2／FiO2），若PaO2／FiO2≤300，提示建模成功；對照組大鼠經尾靜脈注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。建模成功后，大黃素低、高劑量組大鼠分別給予大黃素10，20 mg／kg灌胃，其余組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續14 d。

1.3 觀察指標

動脈血血氣分析：末次給藥2 h后，大鼠每100 g體質量經腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.1 mg麻醉，抽取腹主動脈血液，采用全自動血氣分析儀檢測pH、動脈血氧分壓（PaO2）和PaO2／FiO2。

肺組織濕干質量比（W／D）：取大鼠部分肺組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗表面的血液后擦拭干表面水分，稱定質量，即為濕質量（W）；置真空干燥箱內烘烤22 h后稱定質量，即為干質量（D）；計算W／D。

肺組織病理學：摘除大鼠右下肺葉，以10%甲醛溶液固定、常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成5 μm厚石蠟切片，HE染色，用中性樹膠封片，鏡下觀察肺組織病理學變化。采用Smith評分法對肺水腫、肺泡及間質炎癥、肺泡及間質出血、肺不張和透明膜形成分別評分，計0～4分。無損傷為0分；病變范圍＜25%為1分；病變范圍25%～50%為2分；病變范圍50%～75%為3分；病變滿視野為4分；每組選取10個高倍（400倍）顯微鏡視野，取其平均值，計算肺組織學評分。

肺泡灌洗液中炎性因子：取大鼠左肺進行支氣管肺泡灌洗。左肺中注入2.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，沖洗2～3次后，放入無菌容器中。將肺泡灌洗液在4℃以1 000g離心10 min，分離，收集上清液，采用酶聯免疫吸附（ELISA）法，以酶標儀在450 nm波長處依序測定吸光度（OD）值，根據OD值繪制的標準曲線計算肺泡灌洗液中IL－1β，IL－6，TNF－α計算的含量。

肺組織中AQP4和p－NF－κB蛋白表達：采用Western blotting法檢測。取肺組織樣品，加RIPA裂解液提取總蛋白，以BCA法測定總蛋白含量。樣品經變性后上樣，電泳，轉膜，封閉（5%脫脂奶粉，1 h），加一抗孵育［AQP4抗體（1∶1 000）、p－NF－κBp65抗體（1∶1 000）、NF－κBp65抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000），4℃過夜］，清洗3次，加二抗孵育［對應一抗種屬來源的IgG－HRP標記的二抗（1∶3 000），室溫1 h］回收二抗，清洗3次，加入化學發光試劑，將PVDF膜放入暗盒，壓上X膠片，取出膠片后顯影定影、清洗。采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統分析蛋白條帶的灰度值。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0統計學軟件分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗；計數資料以率（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對動脈血氣的影響

與對照組比較，模型組大鼠各動脈血氣指標均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠動脈血氣指標均明顯升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠動脈血氣分析值比較（±s，n＝10）Tab.1 Comparison of arterial blood gas analysis values of rats ineach group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠動脈血氣分析值比較（±s，n＝10）Tab.1 Comparison of arterial blood gas analysis values of rats ineach group（±s，n＝10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。下圖同。1 mmHg＝0.133 kPa。Note：Compared with those in the control group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with those in the model group，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；as well as the following figures.1 mmHg＝0.133 kPa.

?

2.2 對肺組織W／D值的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺組織W／D明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠肺組織W／D明顯降低（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織W／D值比較Fig.1 Comparison of W／D ratio of lung tissues of rats in each group

2.3 對肺組織病理學的影響

對照組大鼠肺組織均未顯示肺間質水腫、出血、充血和炎性細胞浸潤，且肺結構完整；模型組大鼠肺組織均出現損傷，肺間質水腫、肺結構破壞、出血、充血和炎性細胞浸潤；大黃素低、高劑量組大鼠肺組織的肺間質水腫、肺結構破壞、出血和充血，以及炎性細胞浸潤均明顯改善。詳見圖2 A。與對照組比較，模型組大鼠肺組織學評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠肺組織學評分均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖2 B。

圖2 各組大鼠肺組織病理學比較A.Lung histopathology B.Lung histological scoreFig.2 Comparison of lung histopathology of rats in each group

2.4 對肺泡灌洗液中炎性因子水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL－1β，IL－6，TNF－α水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組大鼠比較，大黃素低、高劑量組大鼠肺泡灌洗液中IL－1β，IL－6，TNF－α水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 各組大鼠肺泡灌洗液中炎性因子水平比較A.IL－1β B.IL－6 C.TNF－αFig.3 Comparison of inflammatory factors levels in BALF of rats in each group

2.5 對肺組織中蛋白表達水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺組織中AQP4和p－NF－κBp65蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，大黃素低、高劑量組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達水平比較A.Protein band B.Statistical dataFig.4 Comparison of AQP4 protein expression levels in lung tissues of rats in each group

圖5 各組大鼠肺組織中p－NF－κBp65蛋白表達水平比較A.Protein band B.Statistical dataFig.5 Comparison of p－NF－κBp65 protein expression levels in lung tissues of rats in each group

3 討論

病原體、毒素、感染、自身免疫因素等均可誘發ALI。研究表明，急性炎癥和氧化應激與ALI的發生有關［6］。臨床治療ALI主要采用保護性肺通氣和使用糖皮質激素，但療效欠佳。油酸因建模簡單且成功率高［7］被廣泛用于復制ALI模型。

黃天鵬等［8］的研究表明，ALI伴TNF－α，IL－6，IL－1β，IL－23等促炎細胞因子的釋放［8］。聶進等［9］研究發現，ALI組大鼠肺泡灌洗液中TNF－α和IL－1β的表達量較對照組明顯增加。本實驗結果顯示，模型組大鼠肺泡灌洗液中IL－1β，TNF－α，IL－6水平相較對照組均明顯升高。

AQP又稱水孔蛋白，是位于細胞膜上的蛋白質，可維持肺泡、肺間質及肺毛細血管間的水平衡，在清除肺泡內多余液體過程中起主導作用［10］。LI等［11］研究發現，抑制AQP4可減輕輻射誘發模型小鼠肺損傷，這與炎性細胞的浸潤減弱，以及促炎細胞因子的產生及M2巨噬細胞的激活均受抑制有關。本實驗結果表明，模型組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達水平較對照組明顯升高。

NF－κB屬核轉錄因子，參與炎性反應、免疫應答、腫瘤生長等多種過程，其信號途徑的活化在ALI發病機制中起重要作用［12］。李莉等［13］研究發現，在ALI組大鼠肺組織中NF－κBp65的磷酸化程度增加。本實驗結果表明，模型組大鼠肺組織中p－NF－κBp65蛋白表達水平明顯升高，與上述文獻報道一致。

大黃素具有多種生物學功能，包括抗炎、抗癌、免疫抑制、抗病毒特性等［14］。大黃素還可治療風濕性關節炎，抑制ERK1／2和p38 MAPK在成纖維樣滑膜細胞中的表達。此外，李劍等［15］等的研究表明，大黃素可抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲，下調分泌蛋白SDF1和CXCR4的表達。本實驗結果表明，大黃素可升高大鼠動脈血氣指標，降低肺W／D，下調炎性細胞因子、AQP4表達及抑制NF－κB信號通路的活性；其中以高劑量大黃素的效果更好。

綜上所述，大黃素能降低急性肺損傷模型大鼠肺W／D，抑制AQP4表達、NF－κB信號通路的活性及炎性因子的釋放，緩解肺組織病理性損傷。該研究可為臨床治療ALI提供參考。