參仙片治療骨質(zhì)疏松癥作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

申麗莎，楊，蔣成英，張安琪，楊巧虹

（1.重慶市中藥研究院，重慶400061；2.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院·重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121；3.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗中心，重慶401147）

骨質(zhì)疏松癥是以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)損壞而導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨病。該病屬中醫(yī)“骨痿”“骨痹”范疇，證候分布特點以“腎精虧損”為主［1］，臨床多采用補腎益精類中藥及其復(fù)方治療。參仙片由淫羊藿、女貞子、仙茅、人參和制何首烏5味中藥材組方，有溫腎益精、補氣養(yǎng)心功效［2－3］。本研究中利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)［4］，構(gòu)建參仙片治療骨質(zhì)疏松癥的藥物成分與靶點及調(diào)控的通路網(wǎng)絡(luò)，為該藥臨床用于骨質(zhì)疏松癥的治療提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

有效成分篩選：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：／／tcmspw.com／），以人參、女貞子、仙茅、淫羊藿為關(guān)鍵詞，檢索其有效成分。以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，參考國內(nèi)外文獻(xiàn)，查找制何首烏的活性成分，利用PubChem網(wǎng)站（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）獲取各活性成分的SMILES式，導(dǎo)入SwissADME平臺（http：／／www.swissadme.ch／），最終收集得符合條件的有效成分。

有效成分相關(guān)靶點收集：利用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的Related Targets，PubChem，Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）對有效成分相關(guān)靶點進(jìn)行預(yù)測，篩選出每味中藥有效成分的潛在靶點，再通過蛋白數(shù)據(jù)庫Uniprot（https：／／www.uniprot.org／）將靶點轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一基因名稱。

潛在靶點獲取：利用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：／／www.genecards.org／），以“Osteoporosis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索并匯總，得到骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)靶點，再通過微生信（http：／／www.bioinformatics.com.cn／）在線作圖工具，將參仙片與骨質(zhì)疏松癥靶點進(jìn)行映射，獲得潛在作用靶點。

1.2 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析

利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“藥物－成分－潛在靶點”的網(wǎng)絡(luò)，并分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得到主要有效成分及靶點關(guān)系。將參仙片的潛在靶點輸入String數(shù)據(jù)庫（https：／／string－db.org／），以 物 種homo sapiens，combined score＞0.4為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到潛在靶點的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.3 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

利 用David 6.8.0數(shù) 據(jù) 庫（https：／／david.ncifcrf.gov／summary.jsp），對參仙片治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。

1.4 成分－靶點分子對接

從Rcsb數(shù) 據(jù) 庫（http：／／www.rcsb.org／）中 下 載PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前三的關(guān)鍵靶點的晶體結(jié)構(gòu)：AKT1（PDB ID：6HHH），白細(xì)胞介素6（IL－6，PDB ID：1ALU），TP53（PDB ID：2VUK），綜 合 運 用PyMol和AutoDock Tools 1.5.6軟件完成分子對接及相關(guān)的可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 有效成分篩選與作用靶點確定

共篩選出參仙片有效成分68個，其中有57個化學(xué)成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中匹配到404個靶點（刪除重復(fù)值后）。

2.2 潛在作用靶點預(yù)測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫得到骨質(zhì)疏松靶點4 441個，將參仙片中的作用靶點與骨質(zhì)疏松癥靶點進(jìn)行映射，獲得共同靶點259個（見圖1）。表明參仙片可能通過多個潛在作用靶點協(xié)同治療骨質(zhì)疏松癥。

圖1 參仙片活性成分靶點與骨質(zhì)疏松癥靶點映射Fig.1 Mapping between targets of active ingredients in Shenxian Tablets and osteoporosis－related targets

2.3 “中藥－有效成分－潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.8.2軟件將5種中藥、57個化學(xué)成分和259個潛在靶點進(jìn)行可視化處理（見圖2）。該網(wǎng)絡(luò)共有409個節(jié)點、1 576條邊，該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的平均degree為7.706 6，接近中心值（BC）平均值0.005 6，緊密度中心性（CC）平均值為0.308 7。其中，有23個活性成分的degree，BC，CC均高于平均值。排名前三的化合物分別為quercetin，moupinamide，citreorosein，推測這3個成分是參仙片防治骨質(zhì)疏松癥的主要活性成分。

圖2 參仙片治療骨質(zhì)疏松癥的“藥物－成分－潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.2″Drug－component－potential target″network of Shenxian Tablets in the treatment of osteoporosis

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將參仙片與骨質(zhì)疏松癥的259個共同靶點輸入String數(shù)據(jù)庫，物種限定為“homo sapiens”，選取minimun required interaction score＞0.4，探尋靶基因相互作用間的作用關(guān)系（見圖3）。該網(wǎng)絡(luò)涉及257個節(jié)點、5 408條邊，其中節(jié)點表示靶基因，邊表示靶基因間的相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果表明，節(jié)點degree均值為42.25。根據(jù)節(jié)點數(shù)值高于2倍degree平均值篩選出29個關(guān)鍵靶點（見圖4），并認(rèn)為這些靶點對參仙片防治骨質(zhì)疏松癥起到了關(guān)鍵作用。按degree排列，排名前三的靶點分別為AKT1，IL－6，TP53，可認(rèn)為這是核心靶點。

圖3 參仙片治療骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of Shenxian Tablets in the treatment of osteoporosis－related targets

圖4 關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of key targets

2.5 靶點的GO功能富集分析

將參仙片的259個潛在靶點錄入David數(shù)據(jù)庫，以P＜0.05為篩選條件，共得到GO富集條目1 084個，其中包括819個生物過程（BP）、87種細(xì)胞組分（CC）和178種分子功能（MF）。各選取排前10名的GO條目繪制柱狀圖（見圖5）。結(jié)果表明，RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、DNA模板轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)的正調(diào)控，藥物應(yīng)答，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，凋亡過程的負(fù)調(diào)控等生物過程均在參仙片防治骨質(zhì)疏松癥過程中發(fā)揮了重要作用。

圖5 GO功能富集分析結(jié)果Fig.5 Results of GO functional enrichment analysis

2.6 靶點的KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析中有121條信號通路（P＜0.05），取排前20名的條目繪制氣泡圖（見圖6），與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的通路主要有細(xì)胞凋亡、TNF信號通路、HIF－1信號通路、FoxO信號通路、PI3K－Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路等。

圖6 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.6 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對接

根據(jù)“藥物－成分－潛在靶點”網(wǎng)絡(luò)的23個主要活性成分，選擇degree大于均值的前3名的活性成分。與PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊笏玫?9個關(guān)鍵靶點的前3個靶點蛋白進(jìn)行分子對接，分子對接結(jié)合自由能越小，則表示受體與配體之間的親和力越大（見表1）。將這3個化合物分別與3個靶點蛋白的結(jié)合進(jìn)行可視化處理（見圖7）。結(jié)果顯示，各活性成分與AKT1，IL－6，TP53均有很好的親和力。

圖7 主要活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接模擬圖Fig.7 Molecular docking simulation of main active ingredients and key targets

表1 活性成分與靶點蛋白的結(jié)合能Tab.1 Binding ability between active ingredients and target proteins

3 討論

正常的骨代謝過程是骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡。骨吸收由破骨細(xì)胞介導(dǎo)，骨形成則由成骨細(xì)胞介導(dǎo)［5］。當(dāng)骨代謝出現(xiàn)異常，骨吸收超過骨形成時，則引起骨質(zhì)疏松癥。遺傳、激素、局部細(xì)胞因子、營養(yǎng)攝入、運動、藥物等因素均會影響骨代謝過程［6］。

參仙片中的5味中藥均屬補益類藥物，對骨質(zhì)疏松癥具有較好的藥理活性［7－15］。本研究中篩選出參仙片中的關(guān)鍵化學(xué)成分57個，關(guān)鍵靶點29個，以及相關(guān)信號通路121條。其中，排前3名的化學(xué)成分分別為quercetin，moupinamide，citreorosein（quercetin為女貞子和淫羊藿的共有成分［16－17］，moupinamide和citreorosein為何首烏的活性成分［18］），而排前3名的靶點分別為AKT1，IL－6，TP53。已有研究發(fā)現(xiàn)，quercetin不僅可上調(diào)BMP2和Smad4的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松癥［19］；還能降低骨內(nèi)SIPS相關(guān)p21，TP53，SASP的水平，使成骨細(xì)胞水平不受影響，進(jìn)而延緩骨細(xì)胞衰老，挽救由雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失［20］。還有研究發(fā)現(xiàn)，quercetin通過抑制ERK1／2與MAPK mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步抑制ERK1／2－MAPK信號通路的傳導(dǎo)，從而改善骨小梁結(jié)構(gòu)數(shù)量，增加骨密度［21］。moupinamide能抑制環(huán)氧合酶（COX）1和COX2的活性，發(fā)揮抗炎、抗氧化的藥理作用，保護成骨細(xì)胞［22］。citreorosein通過抑制MAPK和AKT介導(dǎo)的IKK磷酸化進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄因子NF－κB活化來抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［23］。除了“藥物－成分－靶點”的信息，“靶點－信號通路”在骨質(zhì)疏松癥的作用機制方面也有大量文獻(xiàn)報 道，如AKT1可 控 制Akt1／forkhead box class O（FoxO）3a／Bim信號通路，首先使FoxO3a發(fā)生磷酸化，以防止其核定位，從而抑制下游bim基因的激活，最終抑制成骨細(xì)胞的凋亡［24］。IL－6與人體內(nèi)的激素水平有密切關(guān)系，雌激素和雄激素均可通過激活I(lǐng)L－6基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的受體介導(dǎo)作用，抑制成骨細(xì)胞增殖［25］；反之，雌激素缺失引起的骨質(zhì)疏松模型動物的骨髓細(xì)胞中IL－6水平則顯著升高［26］。在骨質(zhì)疏松癥的患者和模型動物中，TP53基因表達(dá)和血清p53水平均明顯上調(diào)，說明p53水平升高與骨量減少相關(guān)，提示科研人員可通過抑制p53來逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松癥［27］。本研究中不僅采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出參仙片中防治骨質(zhì)疏松癥的活性成分、相關(guān)靶點及分子通路，還對關(guān)鍵成分與靶點分子對接所展現(xiàn)出的良好親和力和穩(wěn)定構(gòu)象進(jìn)行了驗證。

本研究中以參仙片為對象，對其中所含活性成分、作用靶點及生物過程和相關(guān)通路進(jìn)行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)參仙片主要化學(xué)成分及關(guān)鍵靶點可能通過多種信號通路作用于成骨細(xì)胞，刺激成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)骨細(xì)胞代謝，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的目的，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點、多途徑相互作用的結(jié)果。本研究為臨床將參仙片用于骨質(zhì)疏松癥的防治提供了理論基礎(chǔ)，但所收集的疾病和藥物所涉及的靶點可能與目前的熱點研究及報道的側(cè)重點相關(guān)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)收集不全面，尚需進(jìn)一步深入研究和驗證。