黃孢原毛平革菌降解光氧化褐煤的過程特性

李建濤，劉向榮，楊 杰，莊肅凱

(1.商洛學院化學工程與現代材料學院，陜西 商洛 726000；2.西安科技大學化學與化工學院， 陜西 西安 710054；3.陜西省尾礦綜合利用重點實驗室，陜西 商洛 726000)

煤炭是我國最主要的能源物質，在能源結構中長期占據主導地位，同時也是重要的化工原料來源。隨著國家可持續發展戰略的提出，節能和環保已成為社會和經濟發展的目標和重要衡量指標。因此，煤炭，特別是低階煤的清潔高效利用對于我國社會和經濟的健康良性發展至關重要。煤的微生物降解是低階煤清潔高效利用的前沿技術，其主要是利用某些真菌、細菌或放線菌在一定條件下使煤降解為可溶于水的物質、烴類氣體或其它化學品[1-3]，這些降解物可以作為清潔燃料、化工原料、工業添加劑、植物生長促進劑等。煤的微生物降解在室溫、常壓下就能進行，具有設備簡單、條件溫和、能耗低、產物利用價值高等優點[4-6]。然而，低階煤的微生物降解技術還處于實驗室研究階段，離工業化還有一定距離，亟待加大力度研究。

黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)是目前報道較多的煤降解真菌菌株之一，其在生長過程中能夠產生多種對木質素類物質有極強降解能力的酶，而煤中含有類木質素結構，故能被黃孢原毛平革菌降解[7-8]。作者利用馴化的黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤，通過測定分析降解過程中某些特定參數揭示光氧化煤降解特性。

1 實驗

1.1 煤樣及預處理

煤樣為內蒙勝利褐煤(SLH)。

將煤樣破碎至20 mm以下，60 ℃烘3 h，研磨，篩分，選取粒度范圍為0.075～0.150 mm的煤樣。利用旋轉床光化學反應器[9]對煤樣進行光氧化預處理[10]，得到光氧化內蒙勝利褐煤(GSLH)。光氧化預處理條件如下：煤樣20 g，煤樣粒度0.075～0.150 mm，氧氣流量200 mL·min-1，通氧時間40 min，紫外光照射功率150 W，馬達轉速120 r·min-1，氧化反應時間42 h。

1.2 菌株與培養基

黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號CGMCC 3.7212。

改良馬丁液體培養基：蛋白胨5 g，酵母浸粉2 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2～6.6。其固體培養基加瓊脂15 g。

1.3 降解過程的微量熱實驗

采用法國Setaram C80型微量熱計測定黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的微量熱曲線。實驗前先對操作間及實驗器具進行紫外光照射滅菌30 min，利用空調控制室溫為30 ℃。首先，在參比池下層加入26 mg煤樣，上層加入2 mL改良馬丁液體培養基；在樣品池下層加入26 mg煤樣，上層加入2 mL改良馬丁液體培養基，并接種180 μL菌液(孢子濃度為2.3×106個·mL-1)[11]。然后，裝配好連動桿，將反應池和參比池放入微量熱計主體內，設定溫度為303.15 K，待溫度達到平衡后，按下連動桿捅破塑料隔膜，并同時轉動連動桿數圈使煤樣與培養基、煤樣與菌液混合；當溫度達到平衡后，點擊開始，微量熱計記錄熱量變化，得到熱量變化與時間的微量熱曲線。由微量熱曲線可以得到黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的重要熱力學信息[12-14]。

1.4 光氧化內蒙勝利褐煤的降解實驗

取500 mL燒瓶若干，分別加入200 mL改良馬丁液體培養基，按9%接種量接種黃孢原毛平革菌種子液(孢子濃度為2.3×106個·mL-1)；置于恒溫培養箱中，30 ℃、210 r·min-1培養2 d；再按0.013 g·mL-1(以液體培養基計)加入光氧化內蒙勝利褐煤，繼續降解17.8 d[12]。同法進行不加煤的黃孢原毛平革菌純培養實驗和不接種菌的培養基溶煤實驗。在培養0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h取樣過濾，分別測定降解液和純培養液的pH值、表面張力、450 nm處吸光度A450值以及培養基溶煤液的A450值。

pH值的測定：將降解液/純培養液于10 000 r·min-1離心15 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，采用PHS-3C型酸度計測定濾液pH值。

表面張力的測定：采用德國KRüSS公司的K100型表面張力儀測定[15-16]。

A450值的測定：以去離子水為參比，采用TU-1900型紫外可見分光光度計測定。

2 結果與討論

2.1 降解過程的微量熱研究[17-18]

黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的微量熱曲線如圖1所示。

由圖1可知，黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的微量熱曲線大致可分為4個階段：遲緩期(AB段)、指數生長期(BC段)、穩定期(CD段)和衰亡期(DE段)，降解過程中釋放的總熱量為186.73 kJ·g-1，降解時間為15.1 d。

圖1 黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的微量熱曲線Fig.1 Microcalorimetric curve of GSLH degraded by Phanerochaete chrysosporium

黃孢原毛平革菌在指數生長期(BC段)內，菌數量呈指數增加，可用式(1)表示：

nt=n0ek(t-t0)

(1)

式中：n0為指數生長期開始時刻(t0)的菌數量；nt為指數生長期內t時刻的菌數量；k為指數生長期生長速率常數，min-1。

令每個菌在生長過程中單位時間內放出的熱量為P(即熱功率)，則有式(2)、(3):

Pnt=Pn0ek(t-t0)

(2)

Pt=P0ek(t-t0)

(3)

式(3)中：Pt為t時刻的總熱功率；P0為t0時刻的總熱功率。對其兩邊取對數可得式(4)：

lnPt=lnP0+k(t-t0)

(4)

以lnPt對t作圖，并進行一次擬合(圖2)，求得指數生長期生長速率常數k=4.0408×10-4min-1。

圖2 lnPt-t關系曲線及擬合曲線Fig.2 lnPt-t curve and fitting curve

2.2 降解過程的pH值變化

黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的降解液及純培養液的pH值隨培養時間的變化曲線如圖3所示。

圖3 降解液和純培養液的pH值隨培養時間的變化曲線Fig.3 Change curves of pH values of degradation solution and pure culture solution with culture time

由圖3可知，黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的降解液與純培養液的pH值變化趨勢基本一致，均在指數生長期內持續快速升高，在衰亡期內逐漸降低；培養時間相同時，純培養液的pH值高于降解液的。這是因為，黃孢原毛平革菌在生長過程中產生了促使pH值升高的堿性物質(菌體利用氮營養源生長，代謝產生的氨、銨離子以及有機胺類等物質)；而在降解煤的過程中因為黃孢原毛平革菌代謝產生的堿性物質會與煤中的酸性基團反應，從而消耗了堿性物質，導致降解液pH值降低，這也印證了微生物降解煤的堿作用機理。

2.3 降解過程的表面張力變化

黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的降解液及純培養液的表面張力隨培養時間的變化曲線如圖4所示。

圖4 降解液和純培養液的表面張力隨培養時間的變化曲線Fig.4 Change curves of surface tension of degradation solution and pure culture solution with culture time

由圖4可知，黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的降解液與純培養液的表面張力變化趨勢基本一致，隨培養時間的延長均呈減弱趨勢，表明黃孢原毛平革菌在生長代謝過程中產生了表面活性劑，導致生長環境液體表面張力減弱，這也符合微生物降解煤的表面活性劑機理。培養時間相同時，降解液的表面張力均強于純培養液的。這是因為，在黃孢原毛平革菌降解煤的過程中，煤有機分子吸附黃孢原毛平革菌代謝產生的表面活性劑而“自溶”于液體中(表面活性劑降解煤機理)，導致溶液中表面活性劑濃度降低，液體表面張力增強。

2.4 降解過程的A450值變化

黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的降解液、純培養液、培養基溶煤液的A450值隨培養時間的變化如圖5所示。

圖5 降解液、純培養液和培養基溶煤液的A450值隨培養時間的變化曲線Fig.5 Change curves of A450 values of degradation solution,pure culture solution,and medium-coal solution with culture time

由圖5可知，黃孢原毛平革菌純培養液的A450值很小且隨著培養時間的延長變化不大；培養基溶煤液的A450值亦很小，但隨著培養時間的延長稍有增大；而黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的降解液的A450值在遲緩期就有增大趨勢，在指數生長期迅速增大，在穩定期持續增大，在衰亡期略微減小。充分證實黃孢原毛平革菌的作用使得光氧化內蒙勝利褐煤發生了降解。

3 結論

黃孢原毛平革菌降解光氧化內蒙勝利褐煤的微量熱曲線可分為4個階段：遲緩期、指數生長期、穩定期和衰亡期，與黃孢原毛平革菌的生長曲線相符；降解過程釋放的總熱量為186.73 kJ·g-1，降解時間為15.1 d，指數生長期生長速率常數k為4.040 8×10-4min-1。黃孢原毛平革菌在生長代謝過程中產生了堿性物質和表面活性劑，與純培養液相比，降解液pH值降低、表面張力增強；黃孢原毛平革菌純培養液和培養基溶煤液的A450值均很小，充分證實黃孢原毛平革菌的作用使得光氧化內蒙勝利褐煤發生了降解。