基于中紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同產(chǎn)地山茱萸鑒定與分析

安淑靜，王婷，牛豆，韓彬凱，畢淮龍，康杰芳

(陜西師范大學(xué) 教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710119)

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)是山茱萸科(Cornaceae)山茱萸屬(Cornus.Linn)多年生落葉小喬木或灌木，其干燥成熟果肉，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，具有補(bǔ)益肝腎和內(nèi)熱消渴等療效，是中醫(yī)臨床常用于治療消渴癥(糖尿病)的傳統(tǒng)良藥[2-3]。山茱萸的藥用和食用價(jià)值已有1 500多年的歷史，現(xiàn)代研究表明山茱萸具有抗氧化、抑制腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、抗炎和肝臟保護(hù)等作用，發(fā)揮作用的主要活性成分有獐牙菜苷、馬錢苷、山茱萸新苷、原兒茶苷、莫諾苷、沒食子酸和5-HMF等[4-7]。植物的次生代謝產(chǎn)物的品質(zhì)與產(chǎn)地的地理因子是長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果，是一種連續(xù)的、動(dòng)態(tài)的綜合作用[8-9]。孫玲等[10]發(fā)現(xiàn)19批不同產(chǎn)地山茱萸中5種環(huán)烯醚萜苷類成分含量受地域影響，在山茱萸的質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮產(chǎn)地因素。焦媛等[11]通過ICP-MS方法對(duì)5個(gè)產(chǎn)地山茱萸中無機(jī)元素的含量發(fā)現(xiàn)，河南西峽的Sr元素含量最高。采用HPLC方法測(cè)定不同產(chǎn)地山茱萸果核中莫諾苷、沒食子酸、5-HMF和原兒茶酸，陜西寶雞和漢中的化學(xué)成分含量較高[12]。山茱萸的三大主產(chǎn)區(qū)為浙江淳安、陜西佛坪和河南西峽，在四川、安徽、山西和甘肅等地也有分布[13]，道地性藥材的品質(zhì)是中藥現(xiàn)代化的基石。所以，對(duì)山茱萸進(jìn)行產(chǎn)地溯源具有一定的必要性。傳統(tǒng)中藥材的鑒別主要依靠“辨狀論質(zhì)”“看貨評(píng)級(jí)、分檔議價(jià)”，這種傳統(tǒng)的方法經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)、活性成分與性狀特征相關(guān)性研究困難[14-15]。因此，建立一種省時(shí)、科學(xué)的產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系意義重大。

中紅外(mid-infrared reflectance，MIR)光譜反映的是分子中的原子的伸縮和變形振動(dòng)運(yùn)動(dòng)，波數(shù)范圍在4 000～400 cm-1之間[16]。中紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)作為一種新興技術(shù)手段，每一種化合物都有特定的吸收光譜，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)地溯源、品質(zhì)檢測(cè)和真假鑒別等[17-19]。近年來，中紅外結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)廣泛應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地鑒別與質(zhì)量評(píng)價(jià)，為中藥現(xiàn)代化提供新思路[20-22]。本研究采用MIR光譜結(jié)合LR、BP-ANN和SVM對(duì)29批山茱萸建立產(chǎn)地鑒別和藥材活性成分含量測(cè)定模型，為山茱萸藥材產(chǎn)地鑒別和有效成分含量的快速測(cè)定提供科學(xué)、便捷、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

Nicolet IS50 傅立葉交換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；LG-04C微型植物粉碎機(jī)(瑞安市百信藥機(jī)器械廠)；ISO9001電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HY-12壓片機(jī)(北京凱迪萊特儀器設(shè)備有限公司)；U-3000高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；HY-12 壓片機(jī)(北京凱迪萊特儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑

KBr光譜純 (北京市津同樂泰化工產(chǎn)品有限公司)；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純(天津益仁達(dá)化工有限公司)；沒食子酸對(duì)照品、5-HMF對(duì)照品、原兒茶酸對(duì)照品、莫諾苷對(duì)照品、獐牙菜苷對(duì)照品、馬錢苷對(duì)照品、山茱萸新苷對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 材料

2018年10月—2018年12月采自7個(gè)省份(四川、甘肅、陜西、山西、河南、安徽、浙江)的29批次山茱萸藥材，經(jīng)陜西師范大學(xué)植物學(xué)教研室鑒定為山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)，樣本采集信息見表1。

表1 29批次山茱萸樣品采集地點(diǎn)信息

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

將不同產(chǎn)地的29批山茱萸樣品在40 ℃下烘干至恒重，經(jīng)微型植物粉碎機(jī)粉碎后過200目篩，備用。

1.4.2 中紅外光譜采集

將KBr在烘干器中102 ℃干燥24 h后備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)稱取2 mg山茱萸樣品粉末，按大約1∶60的質(zhì)量比與干燥后的KBr晶體均勻混合于瑪瑙研缽中，研磨充分后用壓片機(jī)壓制成薄片，立即置于Nicolet IS 50傅立葉交換紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定。

儀器條件：掃描范圍為4 000～400 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64次，采集背景和樣品光譜前排除水和二氧化碳的干擾。依次將制備好的樣品薄片放于光譜儀中進(jìn)行測(cè)定，采集數(shù)據(jù)。

1.4.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn):取1號(hào)山茱萸樣品，按照上述所示采集方法制成薄片進(jìn)行光譜采集，將同一個(gè)薄片采集5次，采用SPSS軟件計(jì)算其RSD值。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取1號(hào)山茱萸樣品，按照上述所示采集方法制成薄片進(jìn)行光譜采集，將同一個(gè)薄片采集5次，采用SPSS軟件計(jì)算其RSD值。

穩(wěn)定性試驗(yàn):將1號(hào)山茱萸樣品置于干燥器中保存，每隔0.5 h按上述所示采集方法制備并測(cè)定1次，共測(cè)定5次，得到2.5 h內(nèi)同一山茱萸樣品的多個(gè)紅外光譜圖，采用SPSS軟件計(jì)算其 RSD值。

1.4.4 模型建立

采用Essential FTIR軟件讀取光譜數(shù)據(jù)，并將光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為XLS格式，采用MATLAB 2014a軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，歸一化方法為：在-1到1之間歸一，[y，PS]=map minmax(X,ymin,ymax)將X歸一化到y(tǒng)min到y(tǒng)max范圍，公式為：

其中，X是原始數(shù)據(jù)，y是歸一化后的數(shù)據(jù)，xmax為X的最大值，xmin為X的最小值。

篩選出29批山茱萸中紅外光譜的特征數(shù)據(jù)，分別采用LR、BP-ANN和SVM建立基于NIR光譜的山茱萸藥材產(chǎn)地的鑒別模型。為了比較不同的分類模型的效果，首先按照3∶1的比例將光譜數(shù)據(jù)分成訓(xùn)練集和測(cè)試集，本研究將陜西和河南樣品分別記為“1”類和“2”類對(duì)訓(xùn)練集和測(cè)試集的分類正確率分別用識(shí)別率表示。

篩選出29批山茱萸紅外光譜的特征數(shù)據(jù)，設(shè)置訓(xùn)練集與驗(yàn)證集，利用LR、BP-ANN和SVM三種數(shù)學(xué)建模方法，建立基于MIR光譜的山茱萸中7種成分含量預(yù)測(cè)模型，計(jì)算各模型的相關(guān)系數(shù)(R2)、均方誤差(MSE)和平均絕對(duì)誤差(MAD)作為模型性能的指標(biāo)。其中，R2表示可根據(jù)自變量的變異來解釋因變量的變異部分，該值的絕對(duì)值越接近1，表示模型擬合度越高；MSE表示預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的差異程度，該值越大，誤差越大；MAD表示所有單個(gè)預(yù)測(cè)值與算數(shù)平均值的偏差的絕對(duì)值的平均，該值越大，誤差越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIR光譜數(shù)據(jù)

由于實(shí)驗(yàn)儀器環(huán)境、操作等原因，原始光譜開始有噪聲，最終保留4 000～500 cm-1之間的光譜數(shù)據(jù)。29批山茱萸樣品光譜數(shù)據(jù)，見圖1。

圖1 29批次山茱萸藥材中紅外光譜

精密度試驗(yàn):經(jīng)計(jì)算，采集得到的5個(gè)光譜的最大共有峰波數(shù)的RSD值小于0.2%(置信區(qū)間95%)，說明儀器精密度良好，所得數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

重現(xiàn)性試驗(yàn):經(jīng)計(jì)算，采集得到的5個(gè)光譜的最大共有峰波數(shù)的RSD值小于3%，說明實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):經(jīng)計(jì)算，在2.5 h內(nèi)同一山茱萸樣品的5個(gè)紅外光譜圖的最大共有峰波數(shù)的RSD值小于0.3%，說明處理后的山茱萸樣品在2.5 h內(nèi)基本穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果可靠。

2.2 產(chǎn)地模型鑒定與評(píng)價(jià)

陜西省和河南省兩個(gè)主產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)地鑒別模型結(jié)果，見表2。結(jié)果表明，采用SVM結(jié)合MIR光譜建立的產(chǎn)地鑒別模型對(duì)產(chǎn)地的識(shí)別率最高，識(shí)別率為86.21%。

表2 基于MIR光譜的山茱萸藥材產(chǎn)地鑒別模型

為了進(jìn)一步驗(yàn)證各模型的預(yù)測(cè)效果，將29批次山茱萸MIR光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入采用LR、BP-ANN和SVM擬合的預(yù)測(cè)模型中，對(duì)陜西和河南的山茱萸藥材進(jìn)行產(chǎn)地預(yù)測(cè)，將得出的分類正確率均以識(shí)別率表示，見表3。結(jié)果表明，采用SVM結(jié)合MIR光譜建立的產(chǎn)地鑒別模型對(duì)陜西、河南兩地山茱萸藥材的識(shí)別率最高，分別為92.31%和87.50%。

表3 基于MIR光譜的山茱萸藥材產(chǎn)地鑒別模型驗(yàn)證結(jié)果

2.3 活性成分含量測(cè)定模型與評(píng)價(jià)

篩選出29批山茱萸紅外光譜的特征數(shù)據(jù)，利用LR、BP-ANN和SVM三種數(shù)學(xué)建模方法，建立基于中紅外光譜的山茱萸藥材中7種成分含量預(yù)測(cè)模型，計(jì)算各模型的決定系數(shù)(R2)、均方誤差(MSE)和平均絕對(duì)誤差(MAD)作為模型性能的指標(biāo)。在表4所示模型評(píng)價(jià)結(jié)果中，除原兒茶酸外，山茱萸藥材中其他6種成分用SVM法建立模型的R2均大于用LR和BP-ANN建立模型的R2，且用SVM法建立模型的MSE和MAD均大于用LR和BP-ANN建立模型的MSE和MAD，表明用SVM建立的模型所預(yù)測(cè)的山茱萸藥材中6種成分的含量最接近其實(shí)際含量。

參照本課題組前期建立的山茱萸液相指紋圖譜方法測(cè)定山茱萸藥材中7種活性成分的含量[23]，得到山茱萸中7種對(duì)照品HPLC峰值圖，如圖2。按照各標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系及樣品圖譜中各成分相對(duì)保留時(shí)間的峰面積，求得29批山茱萸樣品中7種活性成分的實(shí)際含量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證各模型的預(yù)測(cè)效果，將29批次山茱萸MIR光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入采用LR、BP-ANN和SVM擬合的預(yù)測(cè)模型中，對(duì)山茱萸中的7種化學(xué)成分進(jìn)行含量預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)含量與采用HPLC法測(cè)得的實(shí)際含量進(jìn)行比較。HPLC通過表5和圖3～9的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除原兒茶酸外，山茱萸藥材中其他6種成分用SVM法建立模型的R2均大于用LR和BP-ANN建立模型的R2，說明SVM建立的模型擬合度更高，采用SVM法建立的基于MIR光譜的山茱萸藥材含量預(yù)測(cè)模型更適合山茱萸藥材中多種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

表4 基于MIR光譜的山茱萸藥材中7種成分含量預(yù)測(cè)模型

注:1.沒食子酸，2.5-羥甲基糠醛，3.原兒茶酸，4.莫諾苷，5.獐牙菜苷，6.馬錢苷，7.山茱萸新苷。圖2 山茱萸中7種有效成分對(duì)照品HPLC圖譜

表5 29批次山茱萸中7種成分實(shí)際值與基于MIR光譜預(yù)測(cè)值比較結(jié)果(n=29)

3 討論與結(jié)論

山茱萸為世界三大名貴木本藥材之一[24]，是我國(guó)40種用量較大的重點(diǎn)藥材品種之一，是國(guó)家新增9種按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)之一(國(guó)衛(wèi)食品函〔2019〕311號(hào))。山茱萸在醫(yī)藥和保健品等方面應(yīng)用的需求量巨大，在國(guó)內(nèi)中藥材市場(chǎng)上占據(jù)著舉足輕重的地位。山茱萸種植范圍廣泛、種植基地環(huán)境差異大、采收加工工藝不統(tǒng)一，導(dǎo)致市場(chǎng)上山茱萸的質(zhì)量參差不齊。本實(shí)驗(yàn)采用MIR結(jié)合SVM建立的產(chǎn)地鑒別模型識(shí)別率高，可用于山茱萸產(chǎn)地來源鑒別，進(jìn)而控制山茱萸藥材質(zhì)量。山茱萸藥材傳統(tǒng)的定量方法通常采用高效液相色譜法(HPLC)，在常用的含量測(cè)定方法中，HPLC法分析一個(gè)山茱萸藥材樣品需要 85 min，且對(duì)山茱萸藥材提取液前處理過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、提取過程有損耗。而建立中紅外光譜模型后，掃描一個(gè)樣本約30 s，極大地縮短了分析時(shí)間，采用中紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)樣品的預(yù)處理簡(jiǎn)單、破壞性小、省時(shí),快捷。用MIR結(jié)合SVM建立含量預(yù)測(cè)模型能夠快速對(duì)山茱萸藥材中的活性成分進(jìn)行批量檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率和精確度。

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)的模型，并對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該模型識(shí)別率和擬合度高，適用于山茱萸藥材的產(chǎn)地鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)。