四妙勇安湯抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊炎癥反應的影響

蘇文全，金榮，耿運玲，杜雅薇，吳圣賢

(北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)是慢性炎癥性疾病。炎癥反應在As斑塊的形成、破裂、糜爛、栓塞及誘發急性心腦血管事件中有著重要作用[1]，而斑塊壞死脂質核心中的巨噬細胞源性泡沫細胞是炎癥反應的主要來源[2]。四妙勇安湯是解毒活血法的經典方劑，現臨床上已廣泛用于治療As相關性疾病[3]。然而在As抗炎治療中，相對于其他炎癥因子，血清高敏-C反應蛋白(high-sensitivity C-responsibility protein，hs-CRP)水平的降低是指南推薦的最有效、獨立的治療目標[4]。同時我們在臨床上亦發現，四妙勇安湯是降低hs-CRP的潛在中藥方劑，運用2周能有效降低As患者的血清hs-CRP水平，穩定斑塊。本實驗以血清hs-CRP水平的有效降低為抗炎療效的基礎，圍繞“NF-κB/IL-1β/CRP”通路，具體探討四妙勇安湯抑制As斑塊炎癥反應的作用及可能機制，以期為四妙勇安湯降低hs-CRP及抑制As炎癥反應提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康7～8周齡雄性ApoE-/-小鼠，35只，體質量20～25 g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供。實驗室環境溫度恒定22～24 ℃，濕度50%，明暗交替，自由采食。本研究獲北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與主要試劑

辛伐他汀(舒降之，默沙東公司生產，批號：20080224)；四妙勇安湯由金銀花、玄參、當歸、生甘草組成，免煎顆粒，由北京中醫藥大學東直門醫院提供；高脂飼料(21%脂肪、0.15%膽固醇)，購自京科奧協力飼料有限公司；小鼠高敏C反應蛋白ELISA試劑盒購自美國RapidBio Lab公司(進口分裝，批號2B900s)，IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，二抗購自美國ZYMED公司Sp系列試劑盒。

1.3 主要儀器

4634旋轉式組織脫水機、5235組織包埋機、pM-401石蠟溶蠟箱、CRM-440切片機，均為日本SAKURA公司生產；ICAp-9000型STAR72600酶標儀為美國Jarrel-ASH公司生產，美國Image-pro plus Version 6.0(Ipp6.0)圖像分析軟件。

1.4 模型制備及分組給藥

35只ApoE-/-小鼠先給予普通飼料喂養7～8周，后改用高脂飼料喂養13周。隨機處死5只，于光鏡下確認小鼠心臟主動脈根部AS斑塊形成。隨后將其余30只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、辛伐他汀組、四妙勇安湯組，每組10只，繼續給予高脂飼料喂養。分組后模型組按體質量比例生理鹽水灌胃，辛伐他汀組給藥劑量為3.03 mg/(kg·d)，蒸餾水溶解灌胃。四妙勇安湯組給藥劑量為金銀花4.505 g/(kg·d)、玄參4.505 g/(kg·d)、當歸3.003 g/(kg·d)、生甘草1.501 g/(kg·d)，蒸餾水溶解灌胃。10只C57BL/6J小鼠為正常組，全程普通飲食飼養，按體質量比例生理鹽水灌胃。各組每日給藥1次，連續給藥19周后取材。

1.5 標本采集及處理

成模后禁食12 h取材，采用腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉后摘取眼球取血，離心后血清標本存于-20 ℃冰箱。消毒皮膚，打開胸腔，暴露組織，在無菌條件下取出心臟及主動脈，并在心底部位縱向切開小口(以便固定液滲透)，生理鹽水涮洗，4%多聚甲醛固定。

1.6 血清hs-CRP水平的檢測

按照試劑盒操作說明，采用經典酶聯免疫法測定小鼠血清hs-CRP水平。

1.7 免疫組化法檢測小鼠主動脈根部AS斑塊CD68、IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ的表達

小鼠主動脈組織包埋切片后，采用免疫組化染色兩步法檢測。60 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，PBS液沖洗3 次，3%雙氧水孵育，血清封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育，鏡下觀察。蘇木素染液復染，中性樹膠封片。每組均以PBS代替一抗作為陰性對照。于光學顯微鏡下觀察切片，選取3個不同視野，采用IPP6.0圖像分析軟件進行分析，定量測定斑塊內CD68、IL-1β、NF-κBp65、PPAR-γ陽性表達區域面積占斑塊面積的百分比。

1.8 統計分析

2 結果

2.1 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠血清hs-CRP水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠主動脈根部斑塊的脂質核心增大,纖維帽變薄，其血清hs-CRP水平顯著升高。與模型組比較，四妙勇安湯組血清hs-CRP的水平顯著降低(P<0.05)，辛伐他汀組顯示降低趨勢，但無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組對ApoE-/-小鼠血清hs-CRP水平的影響

2.2 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊CD68表達的影響

正常組小鼠主動脈根部斑塊無CD68表達，模型組CD68表達明顯升高。與模型組比較，辛伐他汀組及四妙勇安湯組斑塊局部CD68表達有降低趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05),見表2，圖1。

表2 各組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊CD68表達的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.四妙勇安湯組圖1 各組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊CD68的免疫組化染色(×200)

2.3 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊IL-1β表達的影響

正常組小鼠主動脈根部斑塊無IL-1β表達，模型組IL-1β表達顯示升高。與模型組比較，辛伐他汀組和四妙勇安湯組的斑塊局部IL-1β表達有顯著降低(P<0.05),見表3，圖2。

表3 各組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊IL-1β表達的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.四妙勇安湯組圖2 各組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊IL-1β的免疫組化染色(×200)

2.4 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊NF-κBp65表達的影響

正常組小鼠主動脈根部斑塊未見NF-κBp65陽性顆粒表達，模型組的NF-κBp65陽性表達明顯增加；與模型組比較，辛伐他汀組有降低趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05)，四妙勇安湯組NF-κBp65陽性表達有顯著降低(P<0.05),見表4，圖3。

表4 各組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊NF-κBp65表達的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.四妙勇安湯組圖3 各組ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊NF-κBp65的免疫組化染色(×200)

2.5 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊PPAR-γ表達的影響

正常組小鼠主動脈根部斑塊無PPAR-γ陽性表達，模型組的PPAR-γ陽性表達明顯增加；與模型組比較，辛伐他汀組和四妙勇安湯組PPAR-γ陽性表達有增高趨勢，但無明顯統計學差異(P>0.05),見表5，圖4。

表5 各組對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊PPAR-γ表達的影響

注：A.正常組；B.模型組；C.辛伐他汀組；D.四妙勇安湯組圖4 各組ApoE-/-小鼠主動脈斑塊PPAR-γ的免疫組化染色(×200)

3 討論

中醫以解毒活血法防治As已得到臨床和基礎研究的廣泛認可[5]。研究表明解毒活血的方劑或單藥能通過抗炎、抗凝、保護血管內皮、改善斑塊內部成分等途徑，延緩As發展，降低急性心腦血管事件的發生。四妙勇安湯是具有清熱解毒、活血化瘀功效的經典方劑，方中以金銀花為君，性味甘寒，直解熱毒；玄參為臣，咸寒涼血，解毒散結；當歸為佐，辛溫通滯，活血化瘀；甘草為使，生以解毒，調和諸藥；全方配伍嚴謹，療效顯著，成為國家中醫藥管理局首批確認的古代經典名方之一。同時現代科學對As斑塊炎癥研究的逐步深入，這有助于揭示四妙勇安湯的藥理機制。研究表明單核細胞遷入斑塊內成為泡沫細胞是斑塊壞死脂質核心的重要組成部分，也是誘發As炎癥反應的主要因素[6]。存在于巨噬細胞表面的清道夫受體CD68是目前最可靠的斑塊內巨噬細胞標記物[7]，能與ox-LDL大量結合而促進巨噬源性泡沫細胞形成，并在一定程度上具有刺激巨噬細胞向M1型轉化的作用[8]。然而單核細胞由血液遷入內膜，發揮吞噬作用并清除沉積于內膜的脂質和壞死物質的過程，是免疫系統保護血管的生理作用，故以抑制單核細胞遷入內皮的方法，并非理想的抗炎治療策略[9]。通過抑制巨噬細胞的炎癥反應，尋找有效的抗炎靶點和信號通路，成為了有效的As抗炎方案[10]。同時抑制炎癥反應，在一定程度上能抵抗炎性衰老，恢復巨噬細胞的生理功能，進而促進As斑塊的消退[11]。

血清hs-CRP水平是目前預測、診斷及風險評估As炎癥反應程度最可靠的指標，亦常作為中醫As之“毒”的生物學標志物，借以評價療效的標準[12]。且CRP直接參與As的病理過程，其與配體結合后能夠激活經典補體途徑和通過招募H因子調節補體的旁路途徑，促進As斑塊炎癥反應，導致不穩定斑塊及血栓的形成[13]。在機制研究中，因CRP本身不能作為直接干預的靶點，調控其上游信號成為了降低CRP的主要方式[14]。目前“IL-1β/IL-6/CRP軸”是產生CRP的最主要途徑，然而IL-6是一個二級信號因子，直接抑制是否具有特定的抗炎作用尚不明確，且存在載脂蛋白B及LDL-C增加的不利影響，暫未能成為可靠的研究靶點[15]。同時Meta分析也顯示，抗炎治療中IL-6上游的IL-1β是更為理想的靶標[16]。IL-1β不僅能有效抑制IL-6 信號，還具有不依賴IL-6，直接影響斑塊炎癥，誘發細胞凋亡的作用。CANTOS臨床試驗也證實抑制IL-1β能有效降低hs-CRP水平，減少心血管事件的發生，是有效的抗炎靶點[17]。對于IL-1β的調節，抑制NF-κB的激活是重要的途徑[18]。研究表明通過激活IKK，誘發磷酸化IκB的泛素化，使得NF-κB活化，從細胞質轉移至細胞核，并結合于DNA鏈上的特定序列而促進炎癥因子IL-1β的基因轉錄[19]。同時國外研究已證實“NF-κB/IL-1β/CRP”是降低血清hs-CRP水平，防治As的有效通路[20]。而對于負反饋調節NF-κB信號途徑，目前活化的 PPARγ是一種常見方式，其激動劑能通過競爭性抑制NF-κB，而減少IL-1β、TNF-α等炎因子表達，在免疫調節和抗炎中同樣發揮著作用[21]。

本實驗中，采用了高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠32周誘發As斑塊炎癥反應的經典模型，并以hs-CRP為研究靶點，對其上游可能的通路進行了初步的探究。研究顯示模型組中血清hs-CRP水平及斑塊局部CD68、IL-1β、NF-κBp65的表達均明顯升高，表明As斑塊中有大量巨噬細胞分化，炎癥反應明顯。與模型組比較，本實驗中辛伐他汀及四妙勇安湯組均未能明顯降低斑塊CD68的表達(P>0.05)，表明對于減少斑塊內巨噬細胞的遷入無明顯作用，其抗炎效應以抑制炎癥反應為主。相比于辛伐他汀的微弱抗炎效應(P>0.05)，四妙勇安湯能有效地降低血清hs-CRP水平(P<0.05)，具有更顯著抑制As炎癥的作用。在有效降低hs-CRP的基礎上，本實驗進一步探索了具體的抗炎分子機制，結果顯示四妙勇安湯能有效抑制CRP上游的IL-1β、NF-κB炎癥因子分泌(P<0.05)，但無明顯激活PPARγ而抑制NF-κB的作用?？梢娝拿钣掳矞怯行Ы档脱録s-CRP水平的藥物，可通過抑制“NF-κB/IL-1β/CRP”通路實現，其效應機制不同于PPARγ激動劑。故在此研究的基礎上，后期進一步明確四妙勇安湯特有的靶向抑制NF-κB而減少IL-1β、CRP分泌的通路、作用成分及獨特抗炎效應，可避免全面抑制NF-κB 所帶來的嚴重副作用。同時本實驗能為臨床開展四妙勇安湯以降低hs-CRP為靶點的抗炎治療提供一定依據，也能為后期探究其降低hs-CRP的可能藥理機制提供一定的參考。