前臂同種異體移植大鼠模型的建立

朱海男 顧斌 謝峰

帶血管復合組織同種異體移植(Vascularized composite tissue allotransplantation，VCA)是一個新的有前景的移植醫學領域，可以用來治療嚴重的、無法用傳統重建方法修復的軟組織損傷。目前，這項技術已經在世界范圍內的很多國家開展，許多不同種類的組織或器官被成功移植，比如手移植、前臂移植、面部移植、腹壁移植、氣管移植等[1-4]，其中上肢移植是開展最多的VCA移植類型。

然而，不同于實質性器官的移植，包括上肢移植在內的VCA仍然被認為處于實驗階段，目前僅個別患者接受了此類手術。原因是大部分的VCA是用于改善生活質量，而非拯救生命；另外，患者術后必須應用具有各種副作用的免疫抑制劑。這類手術對患者的風險和收益應在術前進行謹慎且全面的評估。目前，還需要大量的實驗研究來減少VCA手術面臨的風險，為VCA真正應用于臨床奠定基礎。

大鼠個體較小，容易操控，價格較低，遺傳背景相對固定，被廣泛地應用于VCA實驗[5-9]。但目前還沒有大鼠的肢體移植模型，為此我們嘗試建立該移植模型，以期為今后開展同種異體前臂移植的相關研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和實驗設計

近交系雄性Brown Norway(BN)大鼠(基因表達：RT1n)，體質量250～275 g，用作供體(n=8)；近交系雄性Lewis大鼠(基因表達：RT1l)，體質量250～275 g，用作受體(n=8)。供受體大鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。供者大鼠在移植物被取下后使用過度異氟烷吸入的方法處死，隨后使用脫頸椎的方法確認死亡。受者大鼠在術前、術后即刻和術后4 d給予止痛藥美洛昔康(2 mg/kg)。本研究共進行了8例前肢的同種異體移植。受者鼠與供者鼠之間跨越了完全的主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex，MHC)屏障。其中，3例受者鼠在術后未接受免疫抑制治療，設為對照組；5例受者鼠在術后給予劑量遞減的免疫抑制劑CsA(Novartis Pharma Schweiz AG，Switzerland)直到實驗結束，以防止免疫排斥反應，設為實驗組。CsA給予劑量：第一周16 mg/kg·d，第二周8 mg/kg·d，第三周4 mg/kg·d，第四周及以后2 mg/kg·d。本研究獲上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院倫理委員會批準。

1.2 建立動物模型方法(圖1)

1.2.1 供者鼠手術

受者鼠的切口線包括圍繞肘關節的環形切口，上臂正面、前臂正背面的3條正中線切口。在上臂近端1/3處確認和離斷3條前臂的主要神經，即尺神經、橈神經和正中神經。隨后，在上臂前面向下追蹤正中神經和尺神經直到肘關節水平。在肘關節水平，從尺神經溝內游離并前置尺神經。橈神經同樣被追蹤，深入到二頭肌和肱骨后向外側走行直到肱骨的三角突，在這里橈神經被游離并前置。游離腋動靜脈和肱動靜脈從肘關節水平直到進入胸壁段。隨后在起始處離斷伸肌和屈肌肌群。所有的肌肉連同血管蒂和神經從尺橈骨骨膜下層被掀起直到二頭肌止點水平。術中應特別注意確認和保護骨間血管，需要小心地從骨面剝離骨間血管。隨后，使用直徑0.35 mm的鉆頭在尺骨上鉆2個小孔，鉆孔位置大約在骨離斷位置遠端1～2 mm，隨后在骨間膜近端離斷尺橈骨。在顯微鏡下打磨平整離斷平面。最后，取下的移植物被包在鹽水紗布中，放入50 mL離心管，保存于4 ℃冰箱，等待移植。

A：取下的移植物；B：受區準備；C：骨固定、神經吻合和肌肉群修復后；D：切口關閉。A: Harvested graft; B: Preparation of the recipient; C: After bone fixation, nerve anastomosis and muscular reconstruction; D: Closure of the wound.圖1 大鼠前肢同種異體移植模型的建立Fig.1 Establishment of a rat model of forelimb allotransplantation

1.2.2 受者鼠準備

切口線包括前正中切口和前臂近端1/3處的環形切口。確認尺神經、正中神經和橈神經并向下追蹤到肘關節水平后離斷。另外，橈神經由后方前置到前方。屈肌和伸肌肌群在前臂近端1/3處離斷，并在骨膜下平面從尺橈骨表面剝離下來直到二頭肌止點位置。受者的二頭肌和三頭肌止點被完整保留，以維持肘關節的活動功能。在尺骨上打2個直徑0.35 mm的小孔，位置為骨離斷平面近端1～2 mm，隨后在骨間膜近端位置離斷尺橈骨。

在頸部另行一2 cm長切口。暴露頸外靜脈并將其作為受體靜脈。在胸鎖乳突肌內側找到頸內動脈并將其作為受體動脈。接著，在盡可能遠的位置同時結扎、離斷動靜脈，目的是保留盡可能長的受者血管蒂，方便吻合。頸內動脈通過頸部肌肉的隧道穿到上臂前面位置，目的也是延長血管蒂，方便吻合。

移植前，供者的前臂和切下的受者前臂并列放在一起，以調節兩者長度，確保移植后肢體的長度合適。

1.2.3 移植物的植入

對受者鼠和供者鼠的橈骨骨髓腔使用27號針頭進行擴髓，隨后使用適當長度的27號針作為髓內針，將兩側橈骨連接起來。通過之前鉆的0.35 mm直徑小孔，用0.2 mm的鐵絲連接受者和供者尺骨。7-0單根絲線縫合受者伸肌和屈肌肌群的相對應部分。隨后3根神經以端端吻合的方法依次進行吻合。使用11-0顯微縫合線進行血管的端端吻合，最后使用4-0可吸收線縫合切口。

1.3 大體評估和移植物的組織學評估

術后觀察移植前臂的存活情況、免疫排斥反應情況、感覺運動恢復情況。術后90 d時進行移植物組織學觀察。

術后每天對移植前臂的血供、免疫排斥反應情況(包括顏色的變化、水腫情況、有無變硬等)進行觀察。術后每周記錄移植前臂的運動和感覺恢復情況。前肢的運動恢復包括步態和在日常生活中是否使用移植的前肢。移植前臂的感覺恢復通過指壓實驗確定。術后90 d，存活移植物取材，切片，HE染色，鏡下觀察，評估移植物組織學改變。

2 結果

2.1 手術一般情況

供者鼠的平均手術時間為2 h，受者鼠的平均手術時間為4 h，熱缺血時間為30 min。所有受者鼠都能較好地耐受手術。

A：術后12 d對照組移植物；B：術后20 d對照組移植物；C：術后1個月實驗組移植物；D：術后3個月實驗組移植物組織學評估。A: Graft in control group on POD 12; B: Graft in control group on POD 20; C: Graft in experimental group on POD 30; D: Histological observatin of the graft in experimental group on POD 90.圖2 術后移植物觀察Fig.2 Postoperative graft observation

2.2 大體觀察(圖2)

實驗組術后7 d內術區水腫明顯，其中小部分皮膚發生表皮溶解壞死。但在脫痂后直到實驗結束為止，所有移植物的皮膚保持顏色粉紅、質地柔軟，提示所有移植物的血供良好。所有移植前臂的指甲和毛發在術后20～25 d內重新開始生長。術后，受者鼠沒有發生自噬移植物的現象。實驗過程中前臂的連續性保持良好，沒有發生前肢的關節僵硬。其中，肩關節和肘關節活動在術后10 d恢復正常，并在之后保持了正常的關節活動度。腕關節和指關節在術后2～3個月開始出現肌肉震顫，到實驗結束時，仍沒有恢復正常的大幅度關節運動。但是，受者鼠在術后1～2個月，開始在日?；顒又惺褂靡浦驳那氨郏缗跏澄?、撓臉等。感覺的恢復，即觸覺或保護性收回運動在術后4～6周出現。實驗組有1只大鼠在術后75 d出現排斥反應，表現為皮膚變紅，表皮剝脫伴散在細小出血點。但通過重新加大CsA劑量到8 mg/kg·d，并逐漸遞減到2 mg/kg·d，排斥反應很快得到控制。

對照組，即受者鼠未接受免疫抑制治療組，移植物在術后早期獲得存活，術后12 d開始出現持續加重的紅腫，后逐漸出現皮膚溶解、壞死，肢體變黑，最終萎縮并木乃伊化。

2.3 組織學評估(圖2)

組織學檢測顯示，實驗組移植物內骨組織結構正常，骨細胞活力好，沒有缺血壞死，吸收等情況；骨髓結構正常，可見大量正常骨髓細胞；移植物內肌肉組織、皮膚組織、皮膚附屬器、皮膚下筋膜組織、肌腱等結構無明顯異常。表明移植物血供可靠，且沒有發生明顯排斥反應。

3 討論

自Dubernard等于1998年在法國里昂第一次成功完成了手移植，至今全世界范圍內已經進行了超過100例手或前臂的移植手術。但是，由于術后需要長期使用免疫抑制劑治療，使得這一能顯著提高患者生活質量的新技術至今無法在臨床得到全面開展[10]。

各種VCA相關研究中，實驗動物模型具有非常重要的作用，例如移植后的排斥現象、缺血再灌注損傷、開發更低毒性的免疫抑制劑、更好的組織保存方法等。目前還沒有前臂移植的大鼠模型。雖然在已發表的VCA模型中，有一些模型提供了與前臂相同或者相似的組織構成，例如后肢移植模型、髂骨肌皮瓣模型、帶神經的面部移植模型[11-12]。尤其是1978年建立的后肢移植模型，是最早發表的VCA模型，之后又陸續發表了許多該模型的改進模型。這一模型對VCA的相關研究，包括不同的免疫抑制的方案、嵌合問題、移植物抗宿主反應、免疫耐受誘導等都具有重要意義[13-17]。然而，大鼠的前肢和后肢存在諸多不同。在功能上，后肢主要負責承重和跑動，包括了更多的大塊肌肉組織，而前肢更多負責精細運動。另外，后肢包括更粗大強壯的骨結構，尤其是股骨，是最為常用的帶血供的骨髓移植模型。也就是說，后肢移植與前肢移植相比，往往帶入大量的骨髓組織。而骨髓在移植后的移植物排斥、免疫耐受等現象中都起到較大的作用[18-20]。前肢和后肢同樣存在不同的神經支配和血供系統，并且前肢和后肢中各種組織成分的比例不同。所有的不同均可能導致實驗結果的不同。

基于Greens[21]《大鼠的解剖》一書和針對大鼠前肢和后肢的解剖學研究，大鼠的前肢和人的上肢具有高度相似性，包括極其相似的骨骼肌肉系統、神經系統和血液循環系統。因此，我們認為使用大鼠前肢移植模型應該能更好地研究上肢移植的相關基礎問題。

建立大鼠的前臂移植模型主要有兩個關鍵點：骨的固定和血管蒂的設計。在骨的固定中，有兩個因素需要考慮，即固定的平面和固定的方法。出于對肘關節功能完整性的考慮，本研究中我們保留了上臂的所有肌肉，所以前臂的截骨平面設計在肱二頭肌的止點遠端，在移植物切取過程中要特別小心，不要損傷骨間血管，因為這一血管對尺橈骨的營養非常重要，并且非?？拷哦^肌止點的位置。我們需要小心地將骨間血管從尺橈骨上剝離下來，直到骨間膜的位置，隨后在骨間膜平面進行截骨。動物實驗中使用過的骨的固定方法包括克氏針[16,22]、由注射針改成的髓內針[18,23]和細鋼絲[24]。本研究動物模型中使用的固定方法是髓內針和鋼絲固定的組合，其中髓內針可以防止截骨部位的成角畸形，鋼絲固定可以防止截骨部位的分離畸形，兩者可共同防止旋轉畸形。由于大鼠的尺橈骨非常小，在顯微鏡下進行骨面的平整對于接合后的牢固度非常重要。

肱血管的管徑非常細小(約0.4～0.5 mm)，直到與自肩胛下的血管匯合后到達胸壁表面時，才明顯變粗(約1 mm)。我們發現這一動脈與頸內動脈的口徑相似，雖然同一平面的腋靜脈會比供區的頸外靜脈粗一些、薄一些，但是由于供者鼠與受者鼠的血管管徑都較粗，靜脈的吻合通常不是問題。合適的血管蒂的張力主要通過控制移植物長度來獲得，要盡量切取較長的受者和供者的血管蒂。因為頸內動脈位置較深，我們通常在頸部和肩縫位置打通肌肉下隧道后穿過頸內動脈到前臂位置進行吻合，而不是將頸內動脈跨過這些肌肉后進行吻合。有時候，我們會臨時將移植的前臂固定到胸壁，保持前臂的內收位置，以免術后外展造成對血管的過度牽拉。

遞減劑量的CsA治療是在VCA實驗中被廣泛應用的免疫抑制劑方案，本研究進一步確定了這一方案的可行性。骨的愈合大約在術后3個月時可以完成，與其他大鼠骨折愈合相關實驗的愈合時間吻合[25-27]。我們沒有發現移植肢體的骨形態與對側正常側有明顯不同，也與移植前的狀態一致，表明沒有骨組織的吸收，沒有關節的脫位、骨折等。由于術后觀察時間較短，加之沒有康復訓練計劃，術后3個月時移植側肢體沒有恢復正常的活動功能，但是感覺功能的恢復比較全面，速度也與以往報道的大鼠自體神經損傷后的再生長速度一致[28]。

本研究與以往報道的大鼠后肢模型相比，需要更長的手術時間，骨固定和血管吻合對顯微外科技術的要求較高；移植物中用于組織學或其他實驗分析的組織量較后肢模型少。

4 結論

同種異體前臂移植的大鼠模型是可行的，可較好地模擬臨床前臂移植模型，為相關研究奠定了基礎。