石莼醇提物基于細胞膜損傷的抑菌作用

陳雨晴, 呂 峰, 馬志洲

(福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

植物多酚具有優異的抑菌活性，但其種類繁多、結構復雜，抑菌效果各不相同[1].如從苦蕎麥麩乙酸乙酯提取物中可分離出蘆丁、槲皮素、異槲皮素等多種酚類物質，其中，槲皮素的抗痤瘡丙酸桿菌和抗表皮葡萄球菌性能分別是異槲皮素的16、8倍，而蘆丁僅對表皮葡萄球菌有抑制作用.這可能是槲皮素具有游離的C3-OH結構及高度的親脂性而表現出更強的抑菌性能[2].由于不同研究中多酚的種類、結構及供試菌種有所差異，使得幾乎每種酚類物質都具有其獨特的抑菌作用.

石莼(Ulvalactuca)別名海白菜、海萵苣等，主要分布于黃海西區、東海西區、南海北區、南海南區，是我國資源極為豐富的野生藻類之一[3-4].據報道，石莼多酚具有廣譜的抑菌性能，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌及鏈格孢菌、青霉菌等真菌具有良好的抑制作用；經高效液相色譜(HPLC)分析發現，其主要抑菌作用成分為兒茶酚和表兒茶素等酚類物質[5].基于此，本研究以石莼醇提物為試材，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌為供試菌，著重考察其基于細胞膜損傷的抑菌作用，以期為石莼功能性成分的開發應用提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 材料

石莼粉(80目)為福建海興保健食品有限公司產品；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)由福建農林大學食品科學學院微生物實驗室提供；胰蛋白胨大豆肉湯培養基(tryptone soya broth, TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(tryptone soya agar, TSA)為杭州微生物試劑有限公司產品；碘化丙啶(propidium iodide, PI) 為美國Sigma公司產品；0.1 mol·L-1(pH 7.4)磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)為北京索萊寶科技有限公司產品；氯化鈉、考馬斯亮藍G250、乙醇、磷酸、戊二醛等均為分析純，為國藥集團化學試劑有限公司產品.

儀器有LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊醫療生物儀器有限公司)、SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、MIKRO 220R立式高速冷凍離心機(德國Hettich公司)、SepectraMax i3X酶標儀(美谷分子儀器有限公司)、DDS-11AT電導率儀(上海雷磁儀器廠)、Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)、Nova NanoSEM 230場發射掃描電鏡(美國FEI公司)、HITACHI H-7650透射電鏡(日本日立高新技術公司).

1.2 方法

1.2.1 石莼醇提物樣液的制備 以實驗室自制的石莼乙醇粗提物為試材，按文獻[6]的方法，采用超聲輔助乙醇溶液提取、鋅離子螯合法分離純化制備石莼醇提物.采用福林酚法[7]測定所得樣品中多酚含量為251.8 mg·g-1(以沒食子酸計).將石莼醇提物用無菌去離子水配制成一定質量濃度的樣液，經0.22 μm濾菌器過濾除菌后備用.

1.2.2 供試菌液的制備 分別將凍存于-80 ℃的供試菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌)采用劃線法在TSA平板上活化，挑取單菌落接種于10 mL TSB培養基中，將供試菌于37 ℃培養18 h至對數生長期，于5 000 r·min-1離心10 min收集菌體.菌體用無菌生理鹽水洗滌3次，重懸于無菌生理鹽水中，制成濃度約為108cfu·mL-1的菌液，均在24 h內使用.

1.2.3 最低抑制濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)、最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)的測定 參考Wilson et al[8]的方法并稍作修改.按“1.2.1”的方法分別配制質量濃度為200 mg·mL-1的石莼醇提物樣液，采用二倍稀釋法將其用TSB液體培養基稀釋成不同質量濃度的待測樣液.另取采用“1.2.2”的方法制備的4種菌液加入TSB液體培養基進行稀釋，使其菌液濃度均為106cfu·mL-1.分別取上述各待測樣液100 μL加入96孔無菌培養板中，并分別加入上述稀釋后的各供試菌液100 μL，使各組培養液中石莼醇提物樣液的最終質量濃度分別為100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg·mL-1，最終的菌液濃度均為5×105cfu·mL-1.混勻后放入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，以肉眼未見渾濁的最小質量濃度為MIC.取100 μL未見渾濁的培養液涂布于TSA平板上，并于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，以無菌生長的最小質量濃度為MBC.同時以不加菌液的培養液為陰性對照，以生理鹽水代替待測樣液為陽性對照進行試驗，每組處理均重復3次.

1.2.4 生長曲線的繪制 參考Diao et al[9]的方法并稍作修改.將按“1.2.1”的方法配制的石莼醇提物樣液添加到TSB液體培養基中，使其終質量濃度為1/2×MIC、1×MIC，以不加石莼醇提物樣液的TSB培養液為空白對照.取上述各組培養液20 mL于無菌離心管中，分別加入按“1.2.2”的方法制備的4種菌液100 μL，使菌液濃度均為5×105cfu·mL-1，混勻后置搖床(280 r·min-1、37 ℃)中振蕩培養.每隔2 h各取200 μL培養液加入96孔無菌培養板中，測定其在600 nm波長處的光密度(D).以培養時間為橫坐標，D600 nm為縱坐標，繪制供試菌的生長曲線，每組處理均重復3次.

1.2.5 供試菌培養液電導率的測定 分別移取按“1.2.2”的方法制備的4種菌液20 mL于無菌離心管中，各加入等體積不同質量濃度的石莼醇提物樣液，使其終質量濃度均為0、1×MIC、2×MIC，混勻后置于搖床(280 r·min-1、37 ℃)中振蕩，每隔1 h測定其電導率[10].每組處理均重復3次.

1.2.6 菌體核酸、蛋白質泄露量的測定 按“1.2.5”的方法制備4種菌培養液，置搖床(280 r·min-1、37 ℃)中振蕩4 h.分別取上述4種菌培養液10 mL，于10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液.各取200 μL上清液加入96孔無菌培養板中，測定其D260 nm，考察菌體核酸泄露量；分別再取上清液1 mL，用考馬斯亮藍法[11]測定其D595 nm，考察菌體蛋白質泄露量.每組處理均重復3次.

1.2.7 金黃色葡萄球菌菌體損傷率的測定 參考寧亞維等[12]的方法并稍作修改.取按“1.2.2”的方法培養至對數生長期的金黃色葡萄球菌，用PBS調節菌液濃度約為108cfu·mL-1，分別加入等體積不同質量濃度的石莼醇提物樣液，使其終質量濃度為0、1×MIC、2×MIC，于37 ℃恒溫培養4 h.向上述各培養液中分別加入PI染液，控制其最終質量濃度為10 μg·mL-1，避光染色20 min后，用PBS洗滌菌體3次，采用流式細胞儀(激發波長488 nm、發射波長650 nm)測定菌體損傷率.

1.2.8 細菌超微結構的觀察 按“1.2.7”的方法制備金黃色葡萄球菌培養液，置搖床培養箱(37 ℃)培養4 h.取上述培養液于5 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，用PBS洗滌3次，重懸于2.5%戊二醛-PBS溶液中，于4 ℃下固定12 h.按掃描電鏡、透射電鏡生物樣品制備法[13]進行前處理，在電鏡下觀察菌體超微結構.

1.3 數據處理

采用Excel 2007軟件對試驗數據進行作圖分析；采用DPS 7.05軟件以Duncan新復極差法對各單因素的平均值進行顯著性檢驗.

2 結果與分析

2.1 石莼醇提物的抑菌活性

由表1可知，石莼醇提物對4種菌的MIC、MBC均為1.56～6.25 mg·mL-1，尤其對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強，其MIC、MBC分別為1.56、3.13 mg·mL-1，而對枯草芽孢桿菌的抑制能力最弱，兩指標值均為6.25 mg·mL-1.推測可能是由于菌體細胞結構不同導致敏感性差異[14].金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌(G+)，其細胞壁主要成分為肽聚糖，并結合磷壁酸，而多酚易與二者結合進而破壞細胞壁致菌體死亡.大腸桿菌、沙門氏菌是革蘭氏陰性菌(G-)，其細胞壁外壁含脂蛋白、脂多糖，內壁肽聚糖含量少，不易與多酚結合.因此，多酚對G+的抑制效果通常優于G-.而枯草芽孢桿菌雖然也是G+，但其能夠產生抗逆性很強的芽孢，這可能是石莼醇提物中的多酚對枯草芽孢桿菌抑制效果不佳的原因.

表1 石莼醇提物對4種菌MIC、MBC的影響Table 1 MIC and MBC of U.lactuca ethanol extracts against 4 bacteria

2.2 4種菌的生長曲線

圖1顯示：4種菌的對照組均具有正常的生長曲線，即有明顯的對數生長期，均在18 h后進入穩定期；而加入石莼醇提物后，4種菌的生長曲線均發生明顯變化.當石莼醇提物的濃度為1/2×MIC時，枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別依次延遲至第6、10、12、14小時才開始緩慢生長，且進入穩定期后菌體數目均分別極顯著低于對照組(P<0.01)，表明菌體生長受到明顯抑制；當石莼醇提物濃度為1×MIC時，4種菌均無生長曲線，即D600 nm無變化，表明無菌體生長現象，證實了石莼醇提物對4種菌均具有優異的抑制作用.同樣，董曉敏[15]制備的葡萄籽原花青素也具有高效抑制菌體生長的作用，推測是由于在培養初期加入抑菌液，其分子吸附在細菌表面，形成分子膜，阻礙了營養物質進入細菌體內從而抑制了細菌為增殖期準備的相關產物的合成.

圖1 不同處理下4種菌的生長曲線Fig.1 Effects of U.lactuca ethanol extracts on the growth of bacteria

2.3 石莼醇提物對菌體細胞膜完整性的影響

2.3.1 4種菌培養液的電導率 生物細胞膜受損可使其通透性增大，細胞滲透壓失衡，胞內電解質外泄，導致其培養液的電導率上升.圖2顯示：4種菌在石莼醇提物的作用下，其培養液中的電導率均極顯著提高(P<0.01)，并在3 h后基本趨于穩定；而對照組培養液的電導率僅有略微增加，這可能是由細菌正常死亡所造成的.處理3 h時，1×MIC試驗組中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌培養液的電導率比對照組分別提高了1.07、0.85、1.10、0.82倍，2×MIC試驗組比對照組分別提高了1.95、1.77、1.92、1.73倍.綜上，石莼醇提物可極顯著提高4種菌細胞膜的通透性(P<0.01)，且效果與其質量濃度呈正相關關系.

圖2 石莼醇提物對4種菌培養液電導率的影響Fig.2 Effects of U.lactuca ethanol extracts on the conductivity of bacteria

2.3.2 菌體核酸、蛋白質的泄露量 正常菌體的核酸、蛋白質等大分子物質存在于細胞內，而細胞膜受損則造成膜通透性增大，進而導致胞內的生物大分子物質外泄，因此通過測定培養液中核酸、蛋白質的含量可以了解細菌細胞膜結構的損傷情況.表2顯示，經石莼醇提物處理4 h后，4種菌的核酸、蛋白質泄露量呈劑量依賴方式極顯著上升(P<0.01).1×MIC試驗組中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的核酸泄露量分別是對照組的16、13、14、12倍，2×MIC試驗組分別是對照組的34、28、32、26倍；1×MIC試驗組中金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的蛋白質泄露量分別是對照組的27.91、12.97、17.22、11.13倍，2×MIC試驗組則分別是對照組的46.26、28.81、28.51、26.25倍.表明石莼醇提物可通過提高細菌細胞膜的通透性，促進胞內生物大分子外泄，起到抑菌的效果.石莼醇提物對金黃色葡萄球菌細胞膜的破壞效果最好，抑制作用最強，對大腸桿菌的抑制效果次之，而對枯草芽孢桿菌、沙門氏菌的抑制效果較弱，這與本研究對菌體培養液電導率的測定結果一致.

表2 石莼醇提物對4種菌核酸、蛋白質泄露量的影響1)Table 2 Effects of U.lactuca ethanol extracts on nucleic acid and protein leakage of bacteria

2.3.3 菌體損傷率 當菌體細胞膜受損時，熒光探針PI能夠穿過受損細胞膜進入細胞內將其核酸染色，利用流式細胞儀可對染色菌體進行定量分析，顯示菌體的損傷率.根據4種菌對石莼醇提物的敏感性，選取最具代表性的金黃色葡萄球菌進行進一步研究.從圖3可以看出：對照組的金黃色葡萄球菌基本無PI熒光信號(菌體損傷率為0.05%)，表明細胞膜結構完整，PI無法進入細胞內；1×MIC試驗組的菌體損傷率為24.67%；2×MIC試驗組的菌體損傷率則高達96.42%，表明該組菌體細胞膜損傷嚴重，絕大部分菌體都被PI染色.

圖3 石莼醇提物對金黃色葡萄球菌細胞損傷率的影響Fig.3 Effect of U.lactuca ethanol extracts on cell damage rate of S.aureus

結合“2.3.1”、“2.3.2”結果可知，石莼醇提物呈劑量依賴方式破壞供試菌細胞膜的完整性，導致胞內物質外泄，菌體無法生長繁殖，這與蓮子B型寡聚原花青素對大腸桿菌的作用效果[16]類似.據報道，多酚可通過多個侵入性靶點破壞細菌細胞膜的完整性，起到抑菌或殺菌的作用：如能螯合細菌細胞外膜的二價陽離子，釋放脂多糖，增大膜通透性；能與細胞膜磷脂雙分子層高度結合，降低膜的流動性，并在細胞膜上形成孔道，導致胞內物質滲漏；此外還能與細菌外膜蛋白相互作用，使其沉淀變性，破壞細胞膜物質運輸等功能[17-19].

2.4 菌體超微結構

掃描電鏡下可觀察到金黃色葡萄球菌體細胞表面形態的變化.對照組的菌體呈飽滿球狀，表面均一光滑，為典型球菌形態(圖4a)；1×MIC試驗組中有部分菌體表面粗糙出現褶皺，胞外附有少量內容物(圖4b)；而2×MIC試驗組的菌體細胞膜嚴重萎縮，喪失其固有形態，部分菌體出現孔洞，導致大量胞內物質外泄(圖4c).

a～c表示與其對應區域A～C的局部放大.圖4 金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖(30 000×)Fig.4 Scanning electron microscope images of S.aureus(30 000×)

透射電鏡下可觀察到金黃色葡萄球菌體細胞膜及其內部結構的變化.對照組的菌體形態正常，細胞膜完整并與細胞壁界限分明，細胞質分布均勻(圖5a)；1×MIC試驗組的菌體仍保持球菌基本形態，但部分菌體的細胞膜與細胞壁界限開始出現模糊、細胞質分布不均勻、局部細胞質密度下降，呈逐漸透明等現象(圖5b)；在2×MIC試驗組中，菌體嚴重萎縮，細胞質密度顯著下降，部分菌體因細胞膜破裂而崩潰，致使胞內物質大量泄露(圖5c).

圖5 金黃色葡萄球菌的透射電鏡圖(50 000×)Fig.5 Transmission electron microscope images of S.aureus(50 000×)

結合圖4、圖5可知，金黃色葡萄球菌在不同質量濃度石莼醇提物的作用下，其菌體內部和外部結構均受到不同程度的破壞，且石莼醇提物與菌體受損程度呈明顯的量—效關系，推測石莼醇提物中的多酚可使菌體細胞膜組分溶解與轉變，導致離子穩態失衡，致使細胞膜疏松粗糙甚至破裂瓦解，胞內物質大量外泄，菌體細胞失水萎縮，最終喪失生長、繁殖能力.此結果與丁香酚對金黃色葡萄球菌的作用[20]類似，可使菌體細胞膜表面出現孔洞，直接導致細胞膜崩潰瓦解；但與石榴皮鞣質對金黃色葡萄球菌的作用[21]有所差別，石榴皮鞣質僅能改變菌體外膜形態，使其表面塌陷，并未造成細胞膜破裂.

3 結論

細胞膜是細菌細胞的重要組織結構，具有保護菌體內部環境穩定、調節物質進出等功能；當細胞膜遭到破壞時，菌體滲透壓失衡、代謝紊亂，最終導致其喪失生長、繁殖的能力.本研究結果表明，石莼醇提物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌均有一定的抑制作用，對4種菌的MIC、MBC均為1.56～6.25 mg·mL-1，尤以對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好.進一步研究結果顯示，2×MIC的石莼醇提物能夠破壞絕大部分供試菌體細胞膜的完整性，致使細胞膜上出現孔道，導致核酸、蛋白質大量外泄，胞外電解質濃度增加，電導率顯著上升；PI染料進入破損菌體細胞內對核酸染色的結果顯示，菌體損傷率高達96.42%；通過掃描電鏡、透射電鏡直觀觀察到供試菌體形態變化顯著，細胞膜嚴重皺縮乃至破裂，胞內物質大量泄露.因此，本研究認為細胞膜是石莼醇提物發揮抑菌作用的重要位點.近年來多項研究表明，植物多酚可通過抑制細胞壁、細胞膜及核酸、蛋白質的合成，抑制能量代謝等途徑單獨或者協同發揮抑菌作用[22].需要說明的是，本研究僅針對細胞膜損傷情況進行探討，尚未對其他作用性靶點進行研究；此外，在后續研究中可對石莼醇提物的主要成分及結構加以分析、鑒定，以更深入、系統地探討石莼醇提物的抑菌作用.