依賴于JA信號的蛋白酶抑制劑介導番茄對斜紋夜蛾的抗性

王如夢, 杜逸菲, 高玢垣, 丁元鑫, 孫仲享,2

(1.福建農林大學農學院，福建 福州 350002;2.中山大學有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510275)

番茄(Lycopersiconesculentum)是一種具有重要經濟價值的雙子葉植物，屬于茄科，為一年生或多年生植物，原產于南美洲，現已成為世界上栽培最為廣泛的蔬果之一[1].番茄在整個生長發育階段易受到多種害蟲的嚴重危害，害蟲主要包括蚜蟲、粉虱、螨類、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)等[1-2].其中，斜紋夜蛾屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是分布于全世界的雜食性和暴發性農業害蟲，目前已知宿主植物達90科290多種，主要為害番茄、辣椒、茄子、棉花、大豆、煙草等作物.斜紋夜蛾幼蟲取食量非常大，對番茄等植物有很強的適應力，給農業生產帶來了巨大的威脅[3-4].如何經濟、有效、穩定、持久地控制蟲害的發生以及減小對農作物生態環境的不良影響已成為目前的研究熱點.充分利用植物自身對害蟲的防御機制不僅可以防控害蟲，還可以實現農藥減施與農業可持續發展的目標.

昆蟲侵害會誘導高等植物合成大量抗性相關的化學物質.系統素(systemin)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)被認為是最可能的細胞間創傷信號.系統素是植物受到外界傷害時在細胞質中產生的具有信號傳導功能的內源多肽物質[5].JA是一種廣泛存在于高等植物中的激素，起信號傳遞作用[6]，并被認為是番茄在受侵害時誘導蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor, PI)分泌的主要因子[5].嫁接試驗證明JA是植物系統性抗性反應中的長距離介導因子[7].PI是一類低分子質量的多肽或蛋白質，其基因及其編碼區域較小，一般沒有內含子，參與調節植物許多重要的生命活動，如植物對昆蟲的防衛作用[8-9].Ryan[10-11]研究發現，當番茄植株受到昆蟲侵害后會合成大量PI等抗性相關物質，并且PI不只是在受傷的葉片中被大量合成(局部反應)，未受傷的葉片也能合成(系統反應).研究表明，系統素位于植物創傷信號的上游，是原初信號分子，通過激活十八碳烷酸途徑(octadecanoid pathway)促進JA的合成，進而激活PI等相關防御基因的表達[12].

然而，PI和JA在番茄抗蟲中的關系與功能尚不明確.因此，本試驗以野生型番茄CM、系統素過量表達的轉基因品種35S∷PS(35S∷prosystemin)、JA合成缺陷突變體品種spr8 (suppressorofprosystemin-mediatedresponse8)為材料，研究PI和JA在番茄防御斜紋夜蛾中的功能與誘導效應，以期為進一步研究植物對害蟲的防御機制和植物毒素的合成調控原理，以及開發植物源殺蟲劑奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 番茄種植CM、spr8和35S∷PS的番茄種子均由李傳友教授(中國科學院遺傳與發育生物學研究中心，北京)提供.將試驗所需番茄種子用10% H2O2消毒10 min，蒸餾水沖洗數次，后置于生物培養箱中催芽.待番茄種子發芽生長10 d 后，挑選大小一致的苗，置入花盆(h=12 cm，Φ=10 cm)中，沙子、大田土、花土比為1∶1∶1，在溫室(溫度22 ℃，66% RH，L∶D=16 h∶8 h)內培育，每天定時澆約50 mL的自來水或Holand營養液，待其生長35～40 d供試.

1.1.2 斜紋夜蛾飼養 斜紋夜蛾敏感品系由中山大學昆蟲研究所提供，在福建農林大學作物抗性與化學生態學研究所養蟲室用人工飼料培養[溫度(25±2) ℃，60% RH，L∶D=16 h∶8 h]多代.斜紋夜蛾人工飼料配方：組分A為黃豆粉100 g、麥胚80 g、酵母粉26 g、干酪素8 g、維生素C 8 g；組分B為氯化膽堿1 g、山梨酸2 g、膽固醇0.2 g、肌醇0.2 g；組分C為瓊脂26 g.斜紋夜蛾人工飼料配制步驟：稱取組分A至飼料盒中，加入500 mL超純水，室溫浸泡1 h；稱取組分B至小燒杯中，加入50 mL超純水，玻璃棒攪拌均勻；稱取組分C于另一燒杯中，加入400 mL超純水，浸泡1 h；將浸泡好的組分C于鍋中煮沸，其間用勺子快速攪動，防止粘鍋；往鍋中加入組分B，用50 mL超純水潤洗盛放組分B的容器，潤洗液也倒入鍋中，繼續煮沸；在通風柜往鍋中加入2 mL甲醛，用勺子快速攪勻；待冷卻至60 ℃左右，往鍋中倒入浸泡好的組分A，用勺子快速攪勻，趁熱倒入飼料盒中.配制好的飼料于4 ℃冰箱保存.

1.2 方法

1.2.1 番茄材料對斜紋夜蛾生長影響的測定 通過測定斜紋夜蛾幼蟲在CM、35S∷PS和spr8植株上取食24 h后的體重增量明確不同基因型番茄材料對斜紋夜蛾的抗性.具體方法：挑選長勢一致的3種番茄材料各5盆，以一個側枝為一單位，選取生長發育和體重一致的5頭4齡斜紋夜蛾幼蟲，饑餓2 h后，接入側枝上的番茄葉片，每株番茄各接兩個側枝.24 h后取下番茄上的斜紋夜蛾，用精確度為萬分之一的天平稱重.

1.2.2 番茄葉片取樣 分別選擇6株生長周期一致的CM、35S∷PS和spr8植株，3株作為不接蟲的對照，3株作為接蟲的試驗組.試驗組每株番茄上隨機接入5頭4齡斜紋夜蛾幼蟲，蟲害處理24 h后，用剪刀對未被斜紋夜蛾取食的葉片進行取樣，隨即將葉片樣品置于液氮中，并存貯于-80 ℃冰箱用于后續RNA提取和PI含量測定.

1.2.3 植物總RNA的提取 對被斜紋夜蛾取食24 h后的不同基因型番茄植株的葉片進行液氮研磨，采用上海Promega公司的Eastep Super總RNA提取試劑盒 LS1040提取番茄葉片的總RNA，-80 ℃冰箱貯藏備用.

1.2.4 反轉錄 根據提取的RNA濃度，調整RNA用量，進行反轉錄，反轉錄試劑盒購自上海Promega公司.cDNA合成的PCR體系(20 μL)：GoScriptTM反應緩沖液Oligo (dT) 2 μL，隨機引物2 μL，GoScriptTM酶混合物2 μL，RNA 2 μL，ddH2O 12 μL.將其充分混勻，在PCR儀上進行反轉錄：40 ℃ 20 min；95 ℃ 5 min；4 ℃ 5 min.反應結束后取出并置于-20 ℃冰箱保存備用.

1.2.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析lapA1和pin2是番茄受蟲害誘導的防御基因，也是JA合成基因.本研究通過qRT-PCR技術研究3種基因型番茄材料被斜紋夜蛾取食前后防御基因lapA1和pin2相對表達量的變化.同時，JA可誘導受傷基因表達，從而增加PI的合成.為了驗證3種基因型番茄材料的抗蟲性與番茄中PI含量的相關性，對斜紋夜蛾取食前后番茄PI合成基因PI-Ⅱ相對表達量的變化進行測定.

參考已報道基因的序列設計特異引物對PI-Ⅱ、lapA1和pin2進行qRT-PCR分析[13-14].以β-Actin作為內參基因，基因擴增引物見表1.采用上海Promega公司的M-MLV反轉錄酶合成第一鏈，按照TOYOBO公司SYBR Green Real-time PCR Master Mix-Plus-的程序進行熒光定量PCR反應.引物由鉑尚生物技術有限公司合成.

表1 RT-PCR所用的特異性引物Table 1 Specific primers for real-time PCR

PCR體系：cDNA(稀釋100倍) 4.6 μL，2×UltraSYBR Mixture (High ROX) 5.0 μL，目的基因上、下游引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL，總體積為10 μL.

RT-PCR程序：95 ℃ 10 min ，95 ℃ 10 s ，退火60 ℃ 30 s ，72 ℃ 32 s ，40個循環.融解曲線分析：95 ℃ 15 s ，60 ℃ 1 min ，95 ℃ 15 s ，60 ℃ 15 s.

1.2.6 PI含量的測定 分別取未受蟲害的番茄標記為CM+CK、spr8+CK、35S∷PS+CK，取受蟲害的番茄標記為CM+SL、spr8+SL、35S∷PS+SL.每組取相同部位葉片100 mg，通過以下方法測定PI含量.

(1)在液氮中將樣品凍結并研磨，加入0.3 mL提取緩沖液離心(12 000g, 4 ℃)20 min.將 0.1～0.2 mL上清液轉移到新管中，使用微量布拉德福檢測法[15]確定蛋白質濃度.向上清液中添加1.0～1.2 mL冰冷飽和的硫酸銨，并在冰上靜置1 h(蛋白質沉淀).12 000g、4 ℃離心10 min，去除下層清液，用50 μL 0.1 mol·L-1Tris緩沖液溶解蛋白質顆粒，吹打混勻備用，再次確定蛋白質濃度.

(2)取樣品溶液45 μL加入提前制備好并打孔的平板孔中，密封后水平放入4 ℃冰箱擴散16～18 h.取出后用25 mL新制備的染色液進行染色，37 ℃孵育55 min.

(3)將染色液倒入已染色的容器中，并用水沖洗凝膠.

(4)用尼康SMZ18型體視鏡進行拍照.用ImageJ軟件測量PI抑制區域的直徑，帶入標準曲線計算PI活性.PI含量=PI活性/鮮樣質量(100 mg).

1.2.7 PI對斜紋夜蛾的脅迫處理 準確量取適量大豆胰蛋白酶抑制劑純品，溶解到1 mL雙蒸水中配制成標準溶液，加至60 ℃保存的人工飼料中，充分混勻，配制成含0.2 mg·g-1PI純品的飼料，對照為用1 mL雙蒸水混勻的飼料.

挑選生長發育和體重較一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲，以3頭為一個單位記錄初始體重，以兩種飼料分別飼喂斜紋夜蛾，待其取食48 h后，統計斜紋夜蛾的體重增長率，每組試驗設置10個生物學重復.

1.3 數據統計與分析

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析、整理作圖，多重比較采用Tukey法.用獨立樣本t檢驗差異顯著性，差異顯著性水平為0.05.

2 結果與分析

2.1 番茄材料對斜紋夜蛾生長的影響

由圖1可知，與取食CM相比，取食35S∷PS的斜紋夜蛾體重增量顯著減少，而取食spr8的斜紋夜蛾體重增量顯著增加.這說明35S∷PS對斜紋夜蛾的抗性顯著高于CM，推測系統素可能在番茄抗斜紋夜蛾中發揮重要作用；而spr8抗蟲性顯著低于CM，表明JA信號通路在番茄抵御斜紋夜蛾過程中是必需的.

柱上不同字母表示經Tukey法檢驗在0.05水平上差異顯著.圖1 斜紋夜蛾接入3種基因型番茄24 h后的體重增量Fig.1 Weight gain of S.litura after inoculating with 3 genotypes of tomato for 24 h

2.2 斜紋夜蛾取食對番茄葉片中抗性相關基因表達的影響

由圖2可知：3種基因型番茄材料被斜紋夜蛾取食前，lapA1和pin2基因相對表達量無顯著差異；而斜紋夜蛾取食后35S∷PS中lapA1的相對表達量顯著高于CM；斜紋夜蛾取食后spr8的lapA1和pin2相對表達量顯著低于CM.CM和35S∷PS在被斜紋夜蛾取食后，lapA1和pin2相對表達量比被取食前顯著上升；而spr8在蟲害前后lapA1和pin2基因的表達量無顯著差異.以上結果表明JA對番茄抵御斜紋夜蛾起主導作用.

CK.未接種害蟲的處理；SL.接入斜紋夜蛾的處理.柱上不同字母表示經Tukey法檢驗在0.05水平上差異顯著.圖2 斜紋夜蛾取食對3種基因型番茄葉片防御反應基因lapA1(A)和pin2(B)表達的影響Fig.2 Effects of S.litura feeding on expressions of defense-related genes lapA1(A) and pin2(B) in 3 genotypes of tomato leaves

2.3 斜紋夜蛾取食對番茄葉片中PI含量的影響

由圖3A可知：斜紋夜蛾取食前和取食后35S∷PS中的PI-Ⅱ相對表達量都高于CM；斜紋夜蛾取食前和取食后CM的PI-Ⅱ相對表達量都高于spr8，表明番茄PI-Ⅱ基因的表達依賴于JA信號途徑.CM和35S∷PS在被斜紋夜蛾取食后PI-Ⅱ相對表達量都比被取食前有所上升，說明蟲害可以誘導番茄PI合成基因的表達；而spr8受蟲害前后PI-Ⅱ相對表達量無顯著差異，說明JA對番茄調控PI合成基因的表達起主導作用.

由圖3B可知，CM和35S∷PS在被斜紋夜蛾取食后PI含量比被取食前上升，而spr8被斜紋夜蛾取食前后PI含量無顯著變化.斜紋夜蛾取食前和取食后，35S∷PS的PI含量在3種基因型番茄中均最高，而spr8的PI含量均最低.以上結果表明系統素可以促進PI的表達，而且番茄PI的合成依賴于JA信號途徑.

CK.未接種害蟲的處理；SL.接入斜紋夜蛾的處理.柱上不同字母表示經Tukey法檢驗在0.05水平上差異顯著.圖3 斜紋夜蛾取食對3種基因型番茄葉片中PI-Ⅱ表達量(A)和PI含量(B)的影響Fig.3 Effects of S.litura feeding on PI-Ⅱ expression (A) and PI content (B) of 3 genotypes of tomato leaves

2.4 PI對斜紋夜蛾體重的影響

當斜紋夜蛾取食含PI的飼料時，體重增長率從83.4%極顯著下降到53.3%(P<0.01)，說明飼料中添加PI可顯著抑制斜紋夜蛾的生長.

3 討論

多肽信號分子系統素和植物激素JA在番茄創傷信號中扮演著重要的角色[16].系統素和JA在同一信號途徑中協同作用激活了PI和其他防御相關基因的表達[17].已有研究表明，spr2突變體在JA合成和信號轉導方面發生了缺陷[18]，不能合成JA.本研究中，35S∷PS對斜紋夜蛾的抗性最高；而spr8不能合成JA，故喪失了對蟲害的抗性.此外，斜紋夜蛾取食35S∷PS和CM后，JA合成基因lapA1和pin2的表達量顯著提高，而spr8中這兩種基因的表達量極低.可見，JA信號轉導途徑在調控番茄植株對斜紋夜蛾的抗性中具有重要作用.

PI能抑制昆蟲腸道中的蛋白水解酶,降低昆蟲蛋白降解速率, 從而降低昆蟲的體重和生長速率.研究發現，JA缺失突變體def1番茄在受到機械損傷后PI-Ⅱ表達量下調，在噴施MeJA后恢復表達水平[19].含有0.5%(質量分數)大豆胰蛋白酶抑制劑的人工飼料可顯著抑制斜紋夜蛾2或3齡幼蟲的增長[20].本研究也得到類似結果：被斜紋夜蛾取食后3種基因型的番茄PI含量都有所提高，但spr8中PI含量最低，35S∷PS最高.對PI-Ⅱ基因進行qRT-PCR發現，spr8被斜紋夜蛾取食后PI-Ⅱ基因未被誘導表達；當人工飼料中添加0.2 mg·g-1PI時可顯著抑制斜紋夜蛾4齡幼蟲的生長.這說明PI是番茄中真正抑制斜紋夜蛾生長的效應因子.

植物能敏感覺察到昆蟲的攻擊并迅速啟動其防御信號轉導系統，激活下游的基因合成抗蟲的防御蛋白(如PI)和次生代謝物質(如萜類、生物堿等)，對害蟲產生化學防御[21-22].PI是一種有效的控害因子，其在植物保護中具有很大的控害潛力[23].本研究不但證實了PI對斜紋夜蛾的抗性依賴于JA信號途徑，還進一步證明了外源添加微量PI對斜紋夜蛾的抑制效應，進一步明確了JA和PI在番茄防御斜紋夜蛾中的作用，為進一步研究植物對害蟲的防御、植物毒素的合成調控以及開發植物源殺蟲劑奠定了基礎.