宮頸癌化療近期療效差異與DNA聚合酶ζ亞基REV3基因多態性的關系

楊 然 張清偉 馮 磊 董莉麗 李 松

宮頸癌患病率位居女性生殖系統惡性腫瘤前3位，全球每年宮頸癌新發病例超50萬，死亡病例超26萬?；熓蔷植客砥趯m頸癌治療的主要手段，對控制腫瘤進展、預防宮頸癌復發、轉移有積極作用。但仍有較大一部分宮頸癌患者對化療不敏感，影響其預后。近年來，越來越多證據顯示，DNA損傷修復基因通過多途徑影響化療藥物敏感性。DNA損傷修復系統涉及直接修復、錯配修復、核苷酸切除修復、堿基切除修復等，其中跨損傷DNA合成通路(translesion DNA synthesis，TLS)基因在嚴重創傷修復中的作用越來越得到重視，已證實與含鉑類藥物化療耐藥及放療抵抗有密切關聯。DNA損傷修復為DNA自身修復的主要方式，修復過程由Y家族及B家族多種聚合酶參與，主要包括Y家族REV1，B家族DNA聚合酶ζ(polymerase ζ，Polζ)，屬旁路修復，過程包括DNA聚合酶轉換、堿基摻入及聚合酶延伸、解離。其中Pol ζ為TLS修復過程關鍵參與者，含REV3L蛋白及REV7L蛋白亞基，前者為催化亞基，與REV7L蛋白結合后結構重排，產生與REV1蛋白結合位點，介導DNA損傷部位堿基轉換，與REV蛋白相互作用，募集Pol ζ至DNA損傷部位，產生延伸作用。體外研究發現，敲除REV3基因后，癌細胞對順鉑藥敏增加。食管癌細胞試驗中也得到相同結果。推測上述跨損傷DNA合成途徑對化療藥物敏感性產生影響。但對宮頸癌化療效果與Polζ亞基REV3基因多態性的關系尚未闡明。本研究對Polζ亞基REV3基因多態性與宮頸癌近期療效的關系展開研究，以期為宮頸癌治療提供分子學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年12月河南省南陽市中心醫院收治的宮頸癌患者96例(宮頸癌組)。納入標準：年齡>20歲；經病理確診為宮頸鱗癌，國際婦產科聯盟分期Ⅱ～Ⅳa期；既往未接受手術或抗腫瘤治療；無近期妊娠史；無其他部位腫瘤病史；臨床資料完整。排除標準：復發或轉移性宮頸癌；生殖系統畸形；自身免疫功能缺陷；惡液質；心肝腎肺器質性功能障礙；嚴重貧血(血紅蛋白濃度為30～60 g/L)；嚴重腦血管病如腦血管破裂、腦出血或急性腦梗死等；治療過程中出現無法耐受毒副反應退出者；資料不全。宮頸癌組患者年齡22～68歲，平均(49.51±7.98)歲；按照國際婦產科聯盟分期：Ⅱ期35例，Ⅲ期50例，Ⅳa期11例；病理分化程度：高分化31例，中分化46例，低分化19例。并選擇同期體檢的50例正常健康女性作為對照組，家族無宮頸癌病史，體健，年齡20～67歲，平均(48.97±8.41)歲。兩組研究對象性別、年齡等基線情況均衡可比(

P

>0.05)。

1.2 治療方法 所有宮頸癌組患者均接受順鉑+紫杉醇化療方案，第1天，紫杉醇(華北制藥股份有限公司生產，國藥準字H20084439)135～175 mg/m，3 h滴注完畢；第2天，順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司生產，國藥準字H20010743)50～70 mg/m，靜脈化療。每3周重復，共化療4個周期后評估療效。

1.3 Polζ亞基REV3基因多態性檢測方法 結合既往報道及國際人類基因組單體型圖計劃(Haplotypemap，即HapMap計劃)所公布漢族人群數據庫中篩選Polζ亞基REV3單核苷酸多態性位點，設定條件：最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.1，連續不平衡參數

r

>0.8，篩選rs181294、rs240966、rs465646共3個基因位點，DNA序列上美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)GenBank查詢并確定。宮頸癌組于化療前采集外周靜脈血5 mL，對照組于體檢當日采集，枸櫞酸鈉抗凝管保存，提取外周血白細胞全基因組DNA[DNA抽提試劑盒(QIAamp DNA Mini Mix Kit Qiaen)購自德國Qiagen公司]，濃度及純度滿意后，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法進行基因擴增，Taqman MGB探針對篩選Polζ亞基REV3 rs181294、rs240966、rs465646 3個位點基因多態性進行分型(散點圖、擴增曲線雙驗證)，并采用美國ABI公司1377型測序儀進行DNA直接測序驗證基因分型的準確性。

1.4 近期療效評估 宮頸癌組于化療結束1周內評估治療療效，參照實體瘤療效標準。完全緩解：所有目標可測病灶總和縮小至正常范圍，可測病灶完全消失；部分緩解：所有可測病灶徑線總和(目標結節測定用短徑，其他目標病灶使用長徑)較基線縮小30%以上；穩定：可測病灶徑線總和縮小不超過30%或增大不超過20%；進展：可測病灶徑線總和較基線增加20%，或有新病灶出現。以完全緩解和部分緩解視為化療敏感，作為敏感組；穩定或進展視為化療不敏感，作為非敏感組。

1.5 統計學方法 數據統計分析采用SPSS 24.0軟件。Polζ亞基REV3位點基因型分布采用Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗確定樣本群體代表性；Polζ亞基REV3基因型及等位基因分布采用例或率表示，組間對比用

χ

檢驗；非條件logistic回歸模型計算相對風險比值比(odds ratio，OR)及95%可信區間(95% confidence interval，95%CI)。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 兩組研究對象Polζ亞基REV3基因Hard-Weinberg遺傳平衡性檢驗 Hard-Weinberg遺傳平衡性檢驗結果顯示，宮頸癌組與對照組Polζ亞基REV3基因rs181294、rs240966、rs465646位點基因型分布與預計值比較差異均無統計學意義(

P

>0.05)，滿足Hard-Weinberg遺傳平衡性要求，具有群體代表性。見表1。

表1 宮頸癌組與對照組Polζ亞基REV3基因Hard-Weinberg遺傳平衡性檢驗[例(%)]

2.2 兩組研究對象Polζ亞基REV3基因型分布比較 宮頸癌組、對照組Polζ亞基REV3 rs240966位點基因型分布比較差異無統計學意義(

P

>0.05)，rs181294、rs465646位點基因型分布比較差異有統計學意義(

P

<0.05)，宮頸癌組rs181294位點G/A型、A/A型頻率高于對照組，rs465646位點A/G、G/G基因型頻率高于對照組(

P

<0.05)。見表2。

表2 宮頸癌與對照組Polζ亞基REV3基因型分布比較[例(%)]

2.3 宮頸癌易感性與Polζ亞基REV3基因型分布的關系 攜帶Polζ亞基REV3 rs240966 位點不同基因型分布頻率比較差異無統計學意義(

P

>0.05)。以G/G型為參照，攜帶REV3 rs181294位點A/A基因型可增加宮頸癌易感風險2.713倍；以A/A型為參照，攜帶rs465646位點A/G、G/G基因型增加宮頸癌易感風險4.015、3.571倍(

P

<0.05)。見表3。

表3 宮頸癌易感性與Polζ亞基REV3基因型分布的關系[例(%)]

2.4 宮頸癌易感性與Polζ亞基REV3等位基因分布的關系 攜帶Polζ亞基REV3 rs240966 位點不同等位基因頻率分布差異無統計學意義(

P

>0.05)。以G等位基因為參照，攜帶REV3 rs181294位點A型等位基因可增加宮頸癌易感風險1.765倍(

χ

=8.543，

P

<0.05)；以A等位基因為參照，攜帶rs465646位點G等位基因增加宮頸癌易感風險2.536倍(

χ

=11.411，

P

<0.05)。見表4。

表4 宮頸癌易感性與Polζ亞基REV3等位基因分布的關系[例(%)]

2.5 宮頸癌化療近期效果與Polζ亞基REV3基因型分布的關系 近期化療效果，96例宮頸癌患者完全緩解8例(8.33%)、部分緩解41例(42.71%)、穩定40例(41.67%)、進展7例(7.29%)，分為敏感組(

n

=49)與非敏感組(

n

=47)。敏感組與非敏感組rs240966位點基因型分布比較,差異無統計學意義(

P

>0.05)；以G/G為參考，攜帶rs181294位點G/A基因型、A/A基因型可增加化療不敏感風險2.776、5.591倍(

χ

=22.856、19.600，

P

均<0.05)；以A/A為參照，攜帶rs465646位點A/G、G/G基因型可增加宮頸癌化療不敏感風險2.419、4.369倍(

χ

=5.229、4.721，

P

均<0.05)。見表5。

表5 宮頸癌化療近期效果與Polζ亞基REV3基因型分布的關系[例(%)]

2.6 宮頸癌化療近期效果與Polζ亞基REV3等位基因頻率分布的關系 敏感組與非敏感組攜帶Polζ亞基REV3 rs240966位點基因頻率比較差異無統計學意義(

P

>0.05)。以G等位基因為參照，攜帶REV3 rs181294位點A型等位基因可增加化療不敏感風險2.551倍(

χ

=25.975，

P

<0.05)；以A等位基因為參照，攜帶rs465646位點G等位基因增加化療不敏感風險1.714倍(

χ

=4.623，

P

<0.05)。見表6。

表6 宮頸癌化療近期效果與Polζ亞基REV3等位基因頻率分布的關系[例(%)]

3 討論

DNA聚合酶是參與機體跨損傷DNA合成通路復制后修復過程的重要酶類，可通過適應模板DNA損傷，依據損傷結構及不同聚合酶偏好引入堿基或造成突變。與基因組穩定性及DNA突變均有關聯。Polζ是近年來研究較多，與TLS通路功能有關的DNA聚合酶，可通過聚合酶轉換，降低損傷部位低保真度DNA聚合酶復制延伸，保持基因組穩定性，但不可避免誘導DNA突變?；A研究發現，腦膠質瘤組織中Polζ亞基REV3基因表達高于正常組織，且大部分存在錯配修復缺陷，推測Polζ亞基REV3與腫瘤發生有關。近期也有報道發現，REV3基因多態性與卵巢癌、乳腺癌易感性有關。但對Polζ亞基REV3對宮頸癌化療敏感性的影響尚未明確。

鉑類尤其順鉑系宮頸癌化療一線基礎藥物，通過DNA雙鏈鏈內及鏈間交聯捕獲癌細胞周期，誘導癌細胞凋亡，但癌細胞鉑類藥物耐藥導致其推廣受限。癌細胞對DNA損傷修復能力直接影響化療敏感性，癌細胞突變率上升是導致癌細胞化療耐藥的主要原因。TLS通路作為修復DNA損傷關鍵通路可能為參與癌細胞耐藥的重要機制。前期研究發現，REV3基因影響結腸癌、肺癌等多種癌細胞株克隆合成，敲除REV3基因可減緩細胞G1/S期增殖速度，減少細胞克隆形成，而過表達則可促進克隆形成。Jiang等表示，肺癌模型REV3 rs465646位點基因突變與順鉑耐藥有關。本研究結合以往文獻報道及數據庫篩查結果選擇Polζ亞基REV3 3個位點基因多態性與宮頸癌化療效果關系進行探究，結果發現，攜帶rs181294、rs465646位點基因突變與宮頸癌易感性及宮頸癌化療不敏感有關，與王瑛等報道REV3在卵巢癌中作用的結論相似，說明Polζ亞基REV3基因部分位點基因遺傳變異可能與卵巢癌發病及治療效果有關，推測跨損傷DNA合成通路在宮頸癌細胞鉑類化療耐藥中存在特異性，攜帶Polζ亞基REV3 rs181294位點G/A基因型+A/A基因型及等位基因A均可能增加宮頸癌易感性，降低化療敏感度；攜帶rs465646位點A/G+G/G基因型及等位基因G人群宮頸癌易感性更高，有更低的化療敏感性。進一步推測該位點基因突變可影響TLS通路DNA修復能力，在修復鉑類化療方案所致DNA交聯時，攜帶rs181294位點G/A+A/A基因型、A等位基因及攜帶rs465646位點A/G+G/G基因型及等位基因G宮頸癌患者Polζ亞基REV3可通過誘導多種堿基替換途徑引起癌細胞自發突變，增加宮頸癌易感性及癌細胞化療藥物耐藥，影響近期療效。此外，REV3上述位點基因突變可能影響DNA修復損傷過程堿基序列，導致REV3基因莖環結構改變，降低其轉錄效率，影響化療敏感性。

綜上，Polζ亞基REV3 rs181294、rs465646位點基因多態性與宮頸癌易感性及鉑類化療近期療效有關，攜帶rs181294位點G/A+A/A基因型、A等位基因及攜帶rs465646位點A/G+G/G基因型及等位基因G患者有更高的宮頸癌易感風險及鉑類化療藥物不敏感風險，可作為宮頸癌易感人群篩查及化療敏感性篩查的依據。但馬曉璐表示，人REV3基因受環境因素影響較大，可對環境因子產生應激應答反應造成細胞突變。但本研究尚未分析環境因素對Polζ亞基REV3突變的影響，后續需進一步擴充樣本量，探究REV3基因突變對宮頸癌易感性及化療效果影響的確切機制。