基于多指標測定結合化學計量學的防風飲片質量評價

郭駿騏，張 淼，曹文正，于 澎，高紅梅

（長春中醫藥大學藥學院，長春 130117）

中藥飲片系指在中醫藥理論指導下，根據辨證施治及調劑、制劑的需要，將中藥材加工炮制成具有一定形狀、規格的制成品[1]。作為直接原料藥，飲片的質量至關重要[2]。多組分含量測定[3]、指紋圖譜一致性評價[4]、化學計量學[5]等多種模式被廣泛應用于中藥原料及其相關產品的質量評價中。關于飲片等級劃分的依據，多以外觀性狀結合化學成分含量為主。此外，基于成分-生物活性的評價指標也在飲片分級研究中得到應用[6-8]。防風為傘形科植物防風Szposhnikvia divaricata(Turcz.) Schischk.未抽花莖的干燥根，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙之功效[9]。目前關于藥材的等級標準只在《七十六種藥材商品規格標準》中有收載，指標比較單一[10]。研究[11-13]依照不同的分類依據和分級方法，建立了對于防風的不同質量評價標準。本研究選取不同批次的防風飲片為研究對象，對飲片外觀性狀及內在質量中的多個指標進行考察，并進行統計學分析，對防風飲片的質量進行全面評價，篩選表征內在質量的外觀性狀指標，采用聚類分析對所選飲片進行等級劃分，以期為防風飲片的質量和等級研究提供合理依據。

1 材料

1.1 儀器與試劑 儀器：LC-2030型高相液相色譜儀，日本島津公司；Hypersil ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），大連依利特分析儀器有限公司；FA1204B型萬分之一電子天平，上海精密科學儀器有限公司；AB135-S型十萬分之一分析天平，瑞士梅特勒－托利多公司；3NH-TS6010 臺式分光測色儀，深圳市三恩時科技有限公司；標康SL01-22 數顯游標卡尺（杭州標康科技有限公司）。試劑：升麻素苷對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號Y24S6H3805，純度98%；5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號P05M8F35478，純度98%。甲醇為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號 185366；乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號 186341；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.2 樣品 本研究收集的30 批防風飲片，經長春中醫藥大學蔡廣知副教授鑒定均為傘形科植物防風Szposhnikvia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根的炮制加工品。其中，來自安國市一方藥業有限公司的產于河北的藥材批號是18120203、CP17051901、18110606；安國市聚藥堂藥業有限公司的產于內蒙的藥材批號是1805006、1803001、1809002；安國市譽林藥業有限公司的產于吉林的藥材批號是180301、180902、180503；安國祁安藥業有限公司的產于河北的藥材批號是180403、181102、181201；安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司的產于內蒙的藥材批號是03-19010101、180101、02-19010101；河北仁心藥業有限公司的產于內蒙的藥材批號是13017024、13018003、13017029；安國市同義中藥飲片有限公司的產于河北的藥材批號是18040047、19010002、18110154；河北安國振宇藥業有限公司的產于河北的藥材批號是190101、171201、181202；河北祁新中藥顆粒飲片有限公司的產于內蒙的藥材批號是20170902、20181201、20180501；安國市祁澳中藥飲片有限公司產于內蒙的藥材批號是1711541111、1803541113、1805541132。共30 批，編號是1-30。

2 方法及結果

2.1 防風飲片外觀性狀參數測定

2.1.1 形態學測定 防風飲片為圓形或橢圓形的厚片，每批樣品隨機選取3組，每組100個飲片作為測量對象，以飲片外周最寬處兩端的距離作為直徑，測量并記錄，并計算每批樣品的平均直徑。結果見表1。

2.1.2 顏色測定 1）測色模式，反射光；2）測色空間，采用L*、a*、b*色空間，其中L*代表亮度，a*代表紅-綠色，b*代表藍-黃色，E*ab 代表總色差，公式為E*ab=（L*2+a*2+b*2）1/2；3）測定徑，4 mm；4）觀察視野，10°；5）觀察光源，D65 光（代表自然日光，色溫度6504 k），光源為CIE（國際照明委員會）認可。取防風飲片細粉適量，在D65 光、A 光（代表白熾燈光，2856 k）光源下分別測定顏色，其他參數設定同上，每份樣品平行測定3 次，取平均值。結果見表1。

表1 防風飲片外觀性狀測定結果

2.2 浸出物測定 照醇溶性浸出物測定法《中國藥典》2020 版四部通則2201 項下的熱浸法測定[15]，用乙醇作溶劑。結果見表2。

2.3 指標性成分含量測定 按《中國藥典》2020 版一部防風項下含量測定方法進行測定，測定結果見表2，對照品及供試品圖譜見圖1。

表2 浸出物及指標性成分含量測定結果 %

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）HPLC 圖

2.4 相關性分析 采用SPSS 22.0 軟件對防風飲片直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量進行相關性分析。結果見表3。

表3 相關性分析結果

2.5 主成分分析（PCA）以防風飲片的直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為變量，進行主成分分析。計算特征值及方差貢獻率，以特征值＞1為標準，提取到2 個主成分，累計方差貢獻率達到80.765%，可以代表樣品的大部分信息，結果表明不同產地的樣品之間有較大差異。詳細結果見表4、表5。

表4 主成分分析特征值及方差貢獻率 %

表5 主成分分析因子載荷矩陣

圖2 防風飲片PCA 得分圖

2.6 正交偏最小二乘法判別分析（OLPS-DA）以防風飲片的直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為變量，導入SIMCA 14.1 軟件進行正交偏最小二乘法判別分析。在構建的OLPS-DA 模型中，累計解釋能力參數RX2cum 和RY2cum 分別為0.724 和0.878，預測能力參數Q2cum 為0.785，表明模型的穩定性和預測能力較好，可用于樣品差異的分析。由OLPS-DA得分圖可知，與主成分分析結果相似，30 批樣品能夠被明顯地區分開，見圖3。繪制變量重要性投影圖（variable importance in projection，VIP），以VIP 值>1為度，篩選關鍵變量。在所測定的所有指標中，浸出物（VIP=1.80）、L*（VIP=1.62）及E*ab（VIP=1.45）均大于1，可以認為在2 組樣品差異產生中發揮重要作用。見圖4。

圖3 防風飲片OLPS-DA 得分圖

圖4 防風飲片各指標的VIP 值

2.7 防風飲片等級劃分 初步選擇直徑、L*及E*ab3個指標參與防風飲片的等級劃分，采用SPSS 22.0 軟件，采用組間聯接法，以歐式平方距離為測度，對30批樣品進行進行系統聚類分析和K-均值聚類分析。由圖5 可知，當聚類距離為15 時，所有樣品被分為2 類，與PCA 分析及OLPS-DA 分析結果相似。其中FF-4～FF-6、FF-16～FF-18、FF-25～FF-30 等12 個樣品被聚為一類，其余18 個樣品被聚為另一類。見圖5。根據K-均值聚類分析結果，可初步將30 批防風飲片劃分為2 個等級。其中，一等防風飲片：直徑≤8.4cm，L*≤45.49，E*ab ≤60.27。二等防風飲片：直徑為8.4～10.6 cm，L*為45.49～54.19，E*ab 為60.27～67.03，見表6。按照最低定級原則，在所研究的30 批防風飲片中，無一等品；二等品有14 批（FF-4～FF-6，FF-9，FF-16～FF-9、FF-25～FF-30），其中僅FF-9 的藥材產地為吉林，FF-9 的藥材產地為河北，其余二等防風飲片的藥材產地均為內蒙古。剩余的16批飲片均為統貨。分級結果經過獨立樣本t檢驗，所劃分等級樣品質量有顯著性差異（P＜0.01），表明分級依據合理、可靠。

圖5 防風飲片聚類分析圖

表6 防風飲片最終聚類中心

3 討論

本研究結果表明，防風飲片的直徑與其內在含量有顯著的負相關關系。有學者發現，防風中4 種色原酮含量與根的直徑呈明顯的負相關[14]。本研究旨在尋找防風飲片中能夠表征內在質量的外觀性狀，將其作為指標參與等級劃分。結果表明，直徑以及顏色中的L*、E*ab 與內在質量相關性較大，可作為防風飲片分級研究的重要參考依據。

本研究對不同批次防風飲片的外觀性狀指標和內在質量指標進行檢測，并結合化學計量學方法，對所測內、外指標進行分析。結果表明飲片間的差異主要是因為飲片來源藥材的產地不同。因此，對不同批次防風飲片的分析，揭示了飲片質量與其來源藥材的產地具有一定的相關性，可為防風飲片質量評價以及防風藥材種植基地選擇提供依據。