含微透鏡的零模波導器件用于增強熒光信號強度

付博文，郭 振，俞鵬飛，李傳宇，張芷齊，周連群*

（1.復旦大學 工程與應用技術研究院，上海 200433；2.中國科學院 蘇州生物醫學工程技術研究所，江蘇 蘇州 215163；3.中國科學院 生物醫學檢驗技術重點實驗室，江蘇 蘇州 215163；4.季華實驗室，廣東 佛山 528200；5.中國科學技術大學，安徽 合肥 230026；6.蘇州國科芯感醫療科技有限公司，江蘇 蘇州215163）

1 引 言

零模波導（Zero-Mode Waveguide，ZMW）器件在諸多領域有著廣泛的應用。近年來，隨著非經典光學和納米光子學的發展ZMW被應用于脂質膜與細胞膜等的生物膜研究［1］；高濃度溶液中生物大分子相互作用的分析［2］；DNA、RNA測序［3］；分子反應動力學［4］等方面。ZMW在多樣的生物體系研究中日益活躍，已成為人們了解和認知生物分子工作機制的有效工具。

由ZMW構成的納米結構陣列可用于同時進行大量光學或電化學分析，即使當目標分子在高濃度（μM-mM）的體溶液中存在［5-6］。同時ZMW結構可以將光學顯微光譜的觀察體積限制在10-18L到10-21L的范圍內［7］，相對于全內反射熒光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）10-16L的觀測體積［8］具有更小的觀測范圍，進一步降低了背景熒光的干擾，提升了檢測的靈敏度。而且ZMW利用了在截止時存在于金屬包層波導內部的指數衰減場［9］，當用于高濃度檢測時，相較于傳統近場光學掃描顯微 鏡（Near-field Scanning Optical Microscope，NSOM）零模波導提供了更強的限制和更好的性能［10］。ZMW陣列作為一種新的生物分析化學實用方法，可明確觀察和實時追蹤單個分子的化學反應［11］，允許實時觀察高濃度下的分子動力學，還可以與熒光定量分析［12］、熒光共振能量轉移［13］、熒光光譜等光學探針相結合［14］，并行分析大量的反應或結合事件。此外，ZMW陣列還可以作為多功能器件使用，例如將光學和電化學功能結合在單一的離散結構中實現電化學ZMW［15］。

ZMW器件通常是在金屬薄膜中制備納米孔結構，并且將金屬膜沉積在透明的玻璃基底上。在2003年Levene等人率先利用ZWM實現了較高濃度下的單分子檢測［16］，ZWM器件基底厚度通常在200μm以下，在加工時會遇到諸多困難［17］，因此國內外研究人員先后對基于ZWM的器件的加工工藝與結構進行了改進與優化。早期ZWM器件多采用鋁作為金屬層材料［18］，但鋁的化學性質相對活潑，具有短的光學趨膚深度及高的反射特性，因此研究人員開始采用金來代替鋁，金的化學性質穩定，同時在金表面進行修飾的方法多樣且成熟［19］。ZWM微孔陣列最常見的做法是通過正性電子束膠曝光后通過干法刻蝕的方法獲得。這一結構也可以通過直接在金屬層表面使用聚焦離子束進行刻蝕，但這種方案對設備要求較高且產出率低［20］。隨后科研人員又提出了一種使用金屬剝離制備方案，即在電子束曝光時采用負性膠，曝光后保留膠柱結構，沉積金屬后進行剝離［21］，該方法仍在較小尺寸的孔徑上存在缺陷［22］。Wada等人在近幾年提出了將紫外納米壓印與金屬剝離相結合的方案，并驗證了器件的可行性［23］；Teng等人在最近提出了一種成本較低的工藝方案，先通過傳統光刻制備微米孔，再通過電鍍的方式將孔徑縮小至納米級［24］，但這兩種方法仍在良品率與孔徑的均一度上存在問題［25］。

國內外的研究人員對ZMW器件中納米孔陣列的制備做了大量有價值的研究工作［26］。但在對該器件進行定量分析時主要是對其納米孔陣列底部的微弱熒光進行檢測，然而在如何提升納米孔陣列熒光強度，避免孔與孔之間的熒光串擾仍然缺乏系統的研究。因此，本文在通過實驗確定了構建納米孔陣列的工藝方案，并設計了聚光微透鏡陣列，這種結構在顯著降低孔與孔之間的熒光串擾的同時，還會在孔正下方產生相長干涉對ZMW在進行檢測時的熒光強度起到了明顯的提升。

2 實 驗

2.1 結構設計

ZMW器件結構通常是由透明襯底及表面帶有納米級別直徑通孔的金屬層構成，納米孔直徑通常在200 nm以下［16］，可以通過將大量的微孔同時制備在同一個芯片上來提高ZMW的檢測通量。

ZMW在觀測來自納米孔底部的熒光信號時，收集光學器件通常采用具有較高倍數視場相對較小的高數值孔徑物鏡。所以為了能夠從物鏡所限制的區域中收集到更多的信號，ZMW器件在設計時通常包括密集的納米孔陣列。然而，將反應區域緊密排布在透明玻璃基底上會引起一些影響成像結果的問題，例如反應區域之間的光學串擾，如 圖1（a）所示，仿真結 果如圖2（a）所示。

圖1 結構改進前后效果對比Fig.1 Structural improvement effect comparison

為了改善上述問題，本文在納米孔陣列下方增加了聚光微透鏡陣列，這一結構可通過直接刻蝕石英基底獲得，如圖1（b）所示，增加這一結構有兩個優點：（1）可以起到將納米孔內所發出的光進行匯聚準直避免串擾。（2）可以將入射光匯聚到孔底部，提升激發時的照明強度。圖1（b）示意的是理想微透鏡結構。理想微透鏡邊緣具有弧度在刻蝕工藝中角度控制困難且無法與納米孔陣列加工工藝相兼容，透鏡邊緣改為直線可以簡化制作和提高鏡面的均勻性。納米孔布置在微透鏡上表面正中心，考慮到光刻機在進行套刻時的精度及衍射等問題，將上表面直徑設定為3.5μm，其邊緣用線性擬合理想微透鏡拋物線函數y=x2/4f（其中f表示焦距），并綜合考慮多種物鏡焦距以及工藝上的可行性確定透鏡高度為5μm，使用Lumerical FDTD光學仿真軟件對微透鏡結構進行模擬，側壁與垂直夾角約為20°時得到結果明顯改善，如圖2（b）所示。

圖2 仿真結果對比Fig.2 Comparison of simulation results

從仿真結果上可以看到檢測區域間的熒光串擾明顯減少，透鏡內部由于光的反射產生了相長干涉和相消干涉，而相長干涉最為明顯的區域位于納米孔的正下方，這更利于提升在使用物鏡時所接收到發射光的強度。因此這一結構可以使用具有較小數值孔徑的物鏡，在觀察時能夠獲得更大的視野，同時對光學串擾的減少也可以將陣列的密度進一步提升，從而可以達到高通量檢測的目的。并且更高的熒光強度也使得相機在采集圖像時需要更短的曝光時間，進行每秒多幀的連續采集，以實現對目標分子的實時觀測。

2.2 結構加工

本文提出的器件主要包括納米孔陣列與微透鏡陣列，納米孔陣列使用電子束正膠的刻蝕方案來進行加工，實驗流程如圖3所示。本實驗采用兩英寸康寧7980石英玻璃作為基底，厚度為200±10μm，可見光透過率＞90%。采用丙酮，異丙醇和去離子水，先后依次超聲清洗5 min，以去除表面雜質。通過刻蝕方案進行納米孔陣列加工時步驟如下：（1）金屬沉積；使用電子束蒸鍍機（ULVAC Ei-5z）沉積Ti/Au，厚度10/100 nm（圖a）。（2）電子束曝光：在使用氧等離子體清洗后，旋涂電子束正膠PMMA A4，膠厚約0.25 μm，經過前烘后進行電子束曝光（Raith eLINE Plus），顯影定影后，取出樣品，烘干表面得到曝光圖案（圖3b）。（3）金屬刻蝕：使用離子束（IBEA-150）對金屬層進行刻蝕，將圖案轉移至金屬層（圖3c）。（4）除膠：對殘留的電子束膠通過丙酮，異丙醇，去離子水和氧等離子體進行清洗得到包含納米孔陣列的樣品（圖3d）。

圖3 納米孔加工工藝Fig.3 Steps of nanopore processing

微透鏡陣列加工步驟如圖4所示。（1）涂膠：在已經制得納米孔陣列樣品表面首先旋涂AZ4620，膠厚約5微米，并進行前烘（圖4a）。（2）曝光顯影：使用光刻機（SUSS MA6）進行接觸式光刻套刻，顯影定影后，取出樣品，氮氣吹干表面，經后烘堅膜，在納米孔陣列上方形成掩膜（圖4b）。（3）石英玻璃刻蝕：反應離子刻蝕（NLD-570），刻蝕氣體為CF4與Ar，刻蝕功率為150 W，刻蝕壓強為3Pa，刻蝕速率為400~500 nm·min-1，與光刻膠選擇比約為1∶1，得到微透鏡陣列結構（圖4c）。（4）鍍金屬鋁：電子束蒸鍍機（ULVAC Ei-5z）沉積Al厚度50nm，在微透鏡側壁覆蓋一層不透明的金屬形成聚光微透鏡（圖4d）。（5）Lift-off：使用丙酮，異丙醇和去離子水清洗樣品，將殘留的AZ4620及其表面覆蓋的金屬剝離，并用氧等離子體清洗得到完整的樣品（圖e）。

總而言之，情境教學法對小學數學知識的教學具有十分重要的作用，一線的小學數學教師應當在實踐教學的過程中，積極應用多樣的形式構建教學的情境，促進學生在情境之中，深化對數學知識的認知，提高課堂教學的效果。

圖4 微透鏡加工工藝Fig.4 Steps of microlens processing

3 結果與討論

3.1 納米孔陣列制備結果

在進行器件加工之前，為獲得最佳的曝光條件我們首先進行了電子束曝光劑量測試，劑量范圍從175~550μC·cm-2，梯度25μC·cm-2，每個梯度曝光100個100 nm直徑微孔圖案，共完成50組樣品，電子束曝光后同時進行顯影及刻蝕步驟來避免人為誤差?？涛g完成后通過掃描電鏡對其結構進行了廣泛的表征。

在50組樣品中每組不同曝光劑量的100個孔中抽取15個孔測量其直徑，并取平均值進行孔徑與劑量的統計，結果如圖5所示，50組樣品納米孔尺寸分布直徑特征如圖中條形統計圖所示（方框中所有點都落在分布直方圖內）。通過統計數據可以確定當電子束曝光劑量設定為350μC·cm-2時會得到100 nm直徑的納米孔，該劑量下掃描電鏡表征結果如圖6所示。平均為100.3 nm，標準差為2.41 nm，離散系數為2.4%，表明該工藝具有較好的均一性與穩定性。

圖5 樣品納米孔尺寸統計Fig.5 Nanopore size statistics

圖6 350μC·cm-2劑量下納米孔尺寸Fig.6 Nanopore size at 350μC·cm-2 dose

3.2 微透鏡陣列制備結果

在進行微透鏡陣列制備時，是在已有納米孔陣列的樣品上進行的進一步加工，因此選擇AZ4620光刻膠作為掩膜。有角度的微透鏡陣列是在常規玻璃刻蝕工藝的基礎上進行優化改進的。初始條件為CF4（10 sccm）+Ar（10 sccm），刻蝕功率70 W，刻蝕壓強1 Pa時，初始傾角為2.01°。通過對上述刻蝕參數的調整時透鏡傾角不斷增加。但傾角大于30°時透鏡體積較大，會使得孔與孔之間間距增大，反而降低了檢測效率。圖7（a）為使用熒光染料（FAM，1μg·ml-1）對傾角為13.23°~27.87°樣品填充后在汞燈光源照射下4倍物鏡下的拍攝結果，圖7（b）為以19.58°的樣品為基準對不同樣品單位面積平均亮度進行的統計。圖中可以看出13.23°~21.66°區間平均光強逐漸增加，當角度大于23.59°時由于刻蝕壓力的增加導致石英表面凹凸不平，部分透鏡無法用于熒光信號的匯聚。影響器件整體性能。

圖7 不同角度微透鏡對比Fig.7 Comparison of different angle microlenses

最終確定刻蝕傾角在19°~23°區間。當刻蝕氣體為CF4（30 sccm）+Ar（40 sccm），刻蝕功率為150 W，刻蝕壓強為3 Pa時，可以得到傾角在21.1°±0.7°符合預期的結果，如圖8所示，其刻蝕速率為400~500 nm·min-1，刻蝕時間約為10 min。

圖8 微透鏡加工結果Fig.8 Microlens processing result

3.3 器件功能驗證

圖9是SEM表征完整結構的圖像，左圖顯示了整體陣列結構其中的一部分。右圖顯示出了來自陣列中的單個頂部包含納米孔的微透鏡結構。圖10是FIB表征結果，左圖為FIB切割的剖面圖，從右圖放大的結果可以看到納米孔具有約100 nm的直徑和深度。

圖9 掃描電鏡表征結果Fig.9 SEM characterization results

圖10 微透鏡切面表征結果Fig.10 Microlens section characterization results

本文采用了一種高通量的檢測方法，通過明場光照明，利用光透過率來驗證刻蝕出的ZMW結構的均一性。與SEM表征相比，這種方法的好處在于可以獲得大量的統計數據，在一張圖片中可以捕獲更多數量的納米孔陣列，并進行相互比較。圖11（a）為使用Zeiss Axiocam CMOS相機在明場光照射下一組不同劑量的曝光100nm直徑納米孔圖案的照片，將被照射時能夠通過結構的光進行了量化。圖中的每個正方形中都是由16行組成的陣列，每行100個納米孔。當沿著陣列向下移動時，電子束系統的曝光劑量逐漸減少，導致形成越來越小的納米孔。

圖11 透射光測試結果Fig.11 Result of transmitted light test

接下來本文對常規ZMW器件與改進后增加了微透鏡的樣品進行了比較，通過熒光微球（Fluospheres Carboxylate-Modified Micro‐spheres，0.1μm）填充兩組樣品中的納米孔。外部的激發光為汞燈光源，通過濾光片調波長至488 nm，光斑直徑大小隨物鏡變化，4倍物鏡約7.0 mm，10倍物鏡約2.8 mm，20倍物鏡約1.4 mm，并通過物鏡將光照射到ZMW的金屬層的納米孔檢測區域。由于消逝波在孔內的傳播距離很短，觀測體積會被有效的限制。

在有限的觀測體積中存在的熒光基團將被激發并發出熒光，可以使用與激發相同的顯微鏡物鏡重新收集熒光。二向色鏡和附加濾光片用于將激發光與發射光分開。通過熒光光源激發從樣品底部觀察熒光微球發出的激發光，并通過CMOS相機拍攝進行量化，曝光時間均為0.05 s（20 fps），為得到更為精確的對比結果，所拍攝的圖片格式為16bit tif。圖12為拍攝結果與統計后通過ImageJ量化結果，圖12（a）為無微透鏡樣品的拍攝結果，圖12（b）為包含微透鏡樣品的拍攝結果，圖12（c）為10倍物鏡下選取包含相同數目反應區域的灰度值曲線量化對比結果，圖12（d）為10倍物鏡下對20組樣品相同區域內熒光強度均值的統計對比。圖12（a）~12（b）中從左到右依次為4倍（Olympus UPLFLN4XPH NA0.13）、10倍（Olympus UPLFLN10X2PH NA0.3）與20倍物鏡（Olympus LUCPLFLN20XPH NA0.45）下的拍攝結果。

在10倍物鏡下的進行結果對比，無微透鏡樣品僅拍攝到微弱的熒光變化，包含微透鏡的樣品具有較高的熒光強度。從圖12（c）可看到改進后的結構熒光區域與非熒光區域的灰度值區分明顯，邊界清晰，提升了數據分析時信號提取的能力，通過ImageJ對兩組數據進行信噪比計算改進前SNR=5.43，改進后SNR=53.76，信噪比提升了9倍。從圖12（d）對多組樣品分析可以得出改進前平均灰度值3 368.87，改進后平均灰度值52 178.89，信號強度提升了14.5倍（含微透鏡樣品最小灰度值仍大于無微透鏡樣品主要是由于其受現有加工工藝限制表面金屬膜厚度為50 nm，未能完全阻擋來自非激發區域的背景熒光）。同時ZMW器在實際應用時很多熒光物質并不是恰好落在納米孔的中心區域，會產生很多強度不同的熒光信號，較弱的信號往往會被忽略掉，而從圖12（d）表明改進后結構熒光強度離散系數從18.43%降低到1.86%，離散系數降低了89.91%。改進后的熒光強度具有更好的均一性，說明這一結構對更加微弱的熒光信號檢測能力進一步提升。

圖12 兩組樣品分別在4倍、10倍、20倍物鏡下的結果對比Fig.12 Comparison of the two sets of samples under 4x，10x，and 20x objective lenses

以上結果還表明在本文的測試條件下只包含納米孔的ZMW器件需要在20倍物鏡下才能拍攝到可以定量分析的圖片，而改進后的結構僅需要4倍物鏡。當使用4倍物鏡時器件檢測的區域大小為使用20倍物鏡的25倍，當陣列間距為10μm時可以將陣列數量從10 000提升至250 000，有效提升檢測時的通量。因此改進后的結構可以使相機在較短的曝光時間對微弱熒光信號進行清晰的成像。使得同一密度的樣品可以在倍率更小，數值孔徑更低，視野更寬的物鏡下進行檢測和分析，如果當采用像元尺寸更大，靈敏度更高EMCCD或sCMOS相機進行拍攝以及激發效率更高的激光器做光源時可以進一步提升整體檢測性能。

4 結 論

本文為增強熒光信號強度，解決熒光串擾的問題，設計并研制了一種改進的零模波導器件。通過將微透鏡陣列與納米孔陣列結合，利用微透鏡的光學性質增強信號強度，減小熒光信號的發散角。熒光測試實驗結果表明增加了微透鏡陣列的樣品相對于改進前熒光強度提升了14.5倍，信噪比提升了9倍，且熒光強度分布更為均一。同時通過本文提出的結合微納加工工藝的制備流程所制得的器件納米孔陣列尺度可控，離散性低，經SEM表征和透射光量化測試其離散系數具有相似的取值范圍和變化趨勢，優化刻蝕參數后在熔融石英玻璃表面獲得了性能良好的微透鏡陣列結構，且該器件可以優化陣列排布密度提升檢測通量，增加表面金屬膜厚度降低進一步背景熒光干擾。以上結果表明，本文提出的改進的零模波導器件熒光強度提升明顯，熒光串擾問題得到有效改善，加工方案穩定可靠，為改進ZMW器件的廣泛應用奠定了基礎。