LAMA3在胰腺癌中的預(yù)后價(jià)值及機(jī)制的生物信息學(xué)分析

王維杰，趙森峰，2，曹家輝，2，李冰潔

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052，1.肝膽胰外五科，3.腫瘤科；2.鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河南 鄭州 450052）

胰腺癌是惡性程度最高的消化道惡性腫瘤之一，具有手術(shù)切除率低、轉(zhuǎn)移率高、復(fù)發(fā)率高以及對放化療不敏感的特性，預(yù)后極差[1-2]。研究表明，LAMA3（Laminin subunit alpha 3）基因編碼層粘連蛋白332（Laminin 332，LM-332）α亞基，在不同腫瘤中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，低表達(dá)于胃癌、乳腺癌和前列腺癌等，但在肝癌、胰腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[3-6]。越來越多的證據(jù)表明，LAMA3的異常表達(dá)和甲基化與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，具有重要的靶向研究價(jià)值和生物學(xué)標(biāo)志物意義[7-9]。但是，LAMA3在胰腺癌中的信號通路和預(yù)后評估的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，因此，本研究基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫，明確LAMA3在胰腺癌中的表達(dá)情況，分析其與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性及其在預(yù)后中的評價(jià)作用，通過基因富集分析（gene sets enrichment analysis，GSEA）進(jìn)一步預(yù)測其在胰腺癌中的信號通路，為研究LAMA3在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)采集與處理

本研究中所涉及的胰腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和患者臨床數(shù)據(jù)來自于腫瘤基因組圖譜（the Cancer Genome Alas，TCGA）和基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫，主要利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。首先在TCGA數(shù)據(jù)庫分析LAMA3的差異表達(dá)，繼而采用Cox回歸分析與臨床病理特征的相關(guān)性，進(jìn)而Kaplan-Meier分析與總生存期的關(guān)系。最后，在GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證LAMA3的差異表達(dá)和生存分析。

1.2 差異表達(dá)分析

采用limma R軟件包進(jìn)行Wilcoxon檢測，探討LAMA3在正常組織和腫瘤組織中的差異表達(dá)（|lgFC|＞2且P＜0.01）。本研究利用179例腫瘤組織和4例非腫瘤組織的LAMA3表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，同時(shí)利用4對腫瘤組織和癌旁組織的LAMA3表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對差異表達(dá)分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 單因素和多因素Cox回歸分析

根據(jù)LAMA3 表達(dá)值的中位值，將患者分為高低兩組，將臨床數(shù)據(jù)和風(fēng)險(xiǎn)評分一起進(jìn)行Cox分析，計(jì)算各臨床特征的HR和95%CI，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 預(yù)后評價(jià)與Kaplan-Meier生存分析

根據(jù)LAMA3 表達(dá)值的中位值，將患者分為高低兩組。使用Survival R包繪制ROC曲線，同時(shí)計(jì)算AUC值，ROC曲線下的面積值在0～1之間。在AUC＞0.5的情況下，AUC越接近于1，說明診斷效果越好。AUC在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，AUC在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC在0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性。使用Kaplan-Meier方法對LAMA3 高低表達(dá)組的生存期進(jìn)行分組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選用Log-rank。在P＜0.05的情況下，不同分組的生存曲線離散度越高，表示LAMA3高低表達(dá)組的生存差異越大。

1.5 GSEA通路富集分析

從復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度出發(fā)，通過GSEA的方法，基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫，對基因集合進(jìn)行基于KEGG數(shù)據(jù)庫的生物通路富集分析，從而提取出最相關(guān)的生物通路上的差異基因，更加有利于下游實(shí)驗(yàn)的開展。

2 結(jié)果

2.1 LAMA3在胰腺癌中的差異表達(dá)和配對分析

使用edgeR R包分別計(jì)算TCGA數(shù)據(jù)庫中正常胰腺組織、癌旁和胰腺癌組織的差異表達(dá)，結(jié)果提示無論與正常組織還是癌旁組織相比，胰腺癌組織中LAMA3的表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）（見圖1A、B）。GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證差異表達(dá)分析，結(jié)果提示LAMA3在胰腺癌組織中的表達(dá)高于正常組織（P＜0.05）（見圖1C）。

圖1 LAMA3在胰腺組織的表達(dá)情況

2.2 單因素和多因素Cox回歸分析

將TCGA數(shù)據(jù)庫胰腺癌的分級、淋巴結(jié)的侵犯轉(zhuǎn)移情況、TNM分期及腫瘤的大小等臨床性狀與LAMA3 的表達(dá)情況進(jìn)行單因素Cox回歸分析，結(jié)果提示胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR2.26，P=0.003）和LAMA3 的表達(dá)（HR1.02，P=0.001）與預(yù)后生存相關(guān)（見表1）。進(jìn)一步多因素Cox回歸分析結(jié)果提示胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR1.91，P=0.024）和LAMA3的表達(dá)（HR1.02，P=0.003）與預(yù)后生存相關(guān)，表明LAMA3 是胰腺癌一個重要的獨(dú)立預(yù)后因子（見圖2）。

表1 應(yīng)用單因素Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)中胰腺癌臨床病理特征與總體生存期的關(guān)系

圖2 多因素Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)中胰腺癌臨床病理特征與總體生存期的關(guān)系

2.3 LAMA3高表達(dá)的預(yù)后評價(jià)

根據(jù)LAMA3 表達(dá)的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，5 年總生存率的ROC曲線下面積為0.711（見圖3A），說明我們的模型可以很好地預(yù)測患者的生存情況。針對高表達(dá)組和低表達(dá)組的Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達(dá)組的總生存時(shí)間明顯長于高表達(dá)組（P＜0.01）（見圖3B）。我們通過GEO數(shù)據(jù)集GSE21501 進(jìn)一步驗(yàn)證LAMA3 高表達(dá)與胰腺癌的預(yù)后，結(jié)果與前一致（見圖3C）。綜上可見，LAMA3高表達(dá)是胰腺癌一個獨(dú)立的不良預(yù)后因子。

圖3 LAMA3相關(guān)ROC曲線及生存曲線

2.4 GSEA通路富集分析

基于KEGG生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫，對差異基因集合進(jìn)行GSEA通路富集分析表明，p53信號通路、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、剪接體、蛋白酶體及氧化磷酸化在LAMA3高表達(dá)表型中富集；細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和細(xì)胞黏附分子在LAMA3 低表達(dá)表型中富集，提示LAMA3高表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制密切相關(guān)（見圖4）。

圖4 GSEA通路富集分析

3 討論

胰腺癌是消化道惡性程度最高的腫瘤，由于缺乏早期特異性的診斷標(biāo)志物且腫瘤生物學(xué)行為進(jìn)展迅速，確診為胰腺癌的患者大部分已屬晚期，常伴有早期轉(zhuǎn)移和廣泛的局部性擴(kuò)散，僅20%的患者有外科手術(shù)根治性切除的機(jī)會，而接受系統(tǒng)性化療的晚期患者的中位生存期也只有8個月左右，因此，胰腺癌的5年總生存率在4%～5%[10-11]。此外，針對胰腺癌最常用的腫瘤標(biāo)志物是CA199，然而CA199在疾病早期并沒有明顯升高，其敏感性和特異性也僅為70%[12-13]。因此，深入研究胰腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制并挖掘新的具有高特異性和敏感性的生物標(biāo)志物是改善胰腺癌患者生存預(yù)后的重要措施之一[14]。

LAMA3是層粘連蛋白家族主要成員LM-332的編碼基因之一，研究發(fā)現(xiàn)，LAMA3在胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤中異常表達(dá)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要影響[3-6]；另外，LM-332家族參與了胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和前列腺癌等惡性腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，尤其與胰腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[15-18]。然而，在胰腺癌中尚缺乏針對LAMA3的系統(tǒng)性分析和深度的機(jī)制挖掘。

本研究基于生物信息學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)性地分析了LAMA3 在胰腺癌中的差異表達(dá)，并多方面評估其過表達(dá)對胰腺癌預(yù)后的診斷價(jià)值。分析結(jié)果表明，LAMA3 在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常和癌旁組織，過表達(dá)LAMA3 的胰腺癌患者總體生存期顯著減少。進(jìn)一步單因素和多因素的Cox回歸分析證實(shí)，LAMA3 高表達(dá)可能是胰腺癌一個獨(dú)立的不良預(yù)后因子。Yang等[19]對層粘連蛋白基因家族在胰腺癌中的表達(dá)進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LAMA3 在胰腺癌中顯著高表達(dá)并與其不良預(yù)后密切相關(guān)，聯(lián)合血清LAMC2和CA199水平可增加對早期胰腺癌患者的診斷效能。Kim等[20]聯(lián)合LAMA3、E2F7、IFI44、SLC12A2和LRIG1這5個功能基因構(gòu)建胰腺癌的預(yù)后模型，可有效改善胰腺癌的個體化治療策略，有望成為胰腺癌潛在的新藥物靶點(diǎn)。綜上可見，LAMA3很可能是胰腺癌的一個獨(dú)立預(yù)后因子，在胰腺癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

此外，DNA甲基化和RNA可變剪接等表觀遺傳修飾可調(diào)控LAMA3的表達(dá)，在乳腺癌、胃癌、膀胱癌和卵巢癌等的研究中證實(shí)LAMA3發(fā)生甲基化，具有腫瘤早期診斷意義[21]。LM-332由LNα3、LNβ3和LNγ2鏈組成，LAMA3是LNα3亞基的編碼基因。一方面，LNα3 鏈與其他多肽鏈組成層粘連蛋白，通過層粘連蛋白-受體互作活化黏著斑激酶，進(jìn)而參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)；另一方面，LNα3 鏈的缺失使得細(xì)胞無法聚集半橋粒，層粘連蛋白連接不上細(xì)胞骨架，導(dǎo)致細(xì)胞的黏附性降低。研究表明，LAMA3在乳腺癌、胃癌和膀胱癌中低表達(dá)致使LM-332 無法合成，使得上皮細(xì)胞易于脫離細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[21-22]。然而，目前尚不清楚LAMA3在胰腺癌組織高表達(dá)的具體作用機(jī)制。我們基于KEGG生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫，對差異基因集合進(jìn)行GSEA通路富集分析表明，p53信號通路、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、剪接體、蛋白酶體及氧化磷酸化在LAMA3高表達(dá)表型中富集，而細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和細(xì)胞黏附分子在LAMA3 低表達(dá)表型中富集，提示LAMA3在胰腺癌中過表達(dá)可能參與了癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，值得進(jìn)一步深入的研究和證實(shí)。

綜上所述，LAMA3在胰腺癌中過表達(dá)可能是胰腺癌一個獨(dú)立的不良預(yù)后因子。過表達(dá)的LAMA3可能參與了胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的調(diào)控，有望成為胰腺癌診治的新靶點(diǎn)和生物學(xué)標(biāo)志物。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王維杰負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)收集、資料分析、論文撰寫；趙森峰、曹家輝參與論文修改；李冰潔指導(dǎo)課題設(shè)計(jì)、論文撰寫及最后定稿。