免疫親和柱-高效液相色譜法測定餅干中赭曲霉毒素A的含量

孫小杰 宗凌麗 應月 楊軍麗

摘 要：建立了免疫親和柱-高效液相色譜測定餅干中赭曲霉毒素A的分析方法。樣品經80%甲醇水溶液提取，提取液經免疫親和柱凈化，采用C18色譜柱，以乙腈-水-冰乙酸為流動相，用高效液相色譜儀對餅干中赭曲霉毒素A的含量進行了測定。赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，線性相關系數大于0.999 1，方法的定量限為1.0 μg/kg。樣品的加標回收率為80.33%～97.20%，測定結果的相對標準偏差均小于7.22%（n=6）。該方法具有快速，定量準確，線性相關性理想，可適用于餅干中赭曲霉毒素A的測定。

關鍵詞：高效液相色譜柱;免疫親和柱;赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素是一組結構類似的真菌毒素，有A、B、C、D 4種化合物，主要危及人和動物腎臟，其中毒性最大、與人類健康關系最密切、產毒量最高、對農作物的污染最重及分布最廣的是赭曲霉毒素A[1]。赭曲霉毒素A致癌、致畸、破壞免疫系統，對肝、腎臟造成損害，還可以導致神經中毒[2]。為了保障人民的身體健康，《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規定了谷物及其制品（不包括焙烤食品）中赭曲霉毒素A的限量為5.0 μg/kg[3]。

2021年4月，瑞典通過歐盟食品和飼料快速預警系統通報出口至我國的薄脆餅干中赭曲霉毒素A含量不合格，目前文獻報道的赭曲霉毒素A的方法主要涉及糧食及其制品、咖啡、酒[4-6]，針對餅干中赭曲霉毒素A測定技術的研究較少。因此有必要建立餅干中赭曲霉毒素A的檢測方法，為開展餅干中赭曲霉毒素A的風險監測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：島津LC-20AD型，配有熒光檢測器，日本島津公司;電子天平：XS205型，瑞士 Metler—Toledo公司;固相萃取裝置：Wat200609，美國Waters公司;免疫親和柱：3mL，青島普瑞邦生物工程有限公司;氮吹儀：N-EVAP，美國Organomation公司;離心機：ROTINA 35，德國Hettich公司;甲醇、乙腈，色譜純，美國ROE公司;冰乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、吐溫20，分析純，國藥集團化學試劑有限公司;赭曲霉毒素標準物質，上海安譜實驗科技股份有限公司;實驗室用水為經Mili-Q凈化系統（0.22 μm過濾膜）過濾的超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

（1）赭曲霉毒素A標準儲備液。稱取赭曲霉毒素A標準品

1.0 mg，用乙腈-甲醇溶液（50︰50）溶解并定容至100 mL，配成10 μg/mL的標準儲備液，-20 ℃保存。赭曲霉毒素A標準工作液：準確移取赭曲霉毒素A標準儲備液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和200 μL至100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，分別配成0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的標準工作液，4 ℃保存。

（2）真菌毒素清洗緩沖液。①先將12.5 g氯化鈉、2.5 g碳酸氫鈉溶于約250 mL水中，加入0.05 mL吐溫20，用水定容至500 mL。②磷酸鹽緩沖液。將4.0 g氯化鈉、0.6 g磷酸氫鈉、0.1 g磷酸二氫鉀、0.1 g氯化鉀溶于約490 mL水中，用濃鹽酸調節pH至7.0，用水定容至500 mL。

1.2.2 樣品提取

稱取粉碎均勻的試樣25.0 g，加入100 mL甲醇-水溶液（80︰20），高速均質5 min后用定量濾紙過濾，準確移取4 mL濾液于離心管中，加入26 mL磷酸鹽緩沖液后混勻，混合液備用。

1.2.3 樣品凈化

將免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下，將混合液分兩次注入玻璃注射器中。調節流速約1滴/s，直至空氣進入親和柱中，依次用真菌毒素清洗緩沖液10 mL、水10 mL連續淋洗親和柱，調節流速1～2滴/s，棄去全部流出液，抽干親和柱。加入1.5 mL甲醇，調節流速約為1滴/s，用試管收集全部洗脫液，在45 ℃下水浴氮氣吹干，用500 μL流動相溶解，供檢測用。

1.2.4 提取溶劑的選擇

甲醇-水溶液（80︰20）與乙腈-水溶液（60︰40）作為提取溶劑，回收率能達到90%以上，但考慮到乙腈的毒性，選擇甲醇-水溶液（80︰20）作為提取溶劑。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse plus-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m，美國agilent公司）;柱溫35 ℃;熒光檢測器激發波長333 nm，發射波長460 nm;流動相：乙腈-水-冰乙酸（48︰51︰1），等度洗脫;流速：1.0 mL/mL;進樣量：50 ?L。

2 結果與分析

2.1 線性方程與定量限

赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL濃度范圍內，標準溶液的質量濃度x與色譜峰面積y呈良好的線性關系（r≥0.999 1），線性方程為y=9 915.48x+1 391.31，以信噪比為S/N≥10時確定定量限為1.0 μg/kg，歐盟規定餅干中赭曲霉毒素A限量值為3.0 μg/kg，方法定量限滿足檢測的需求。

2.2 方法回收率與精密度試驗

通過向陰性樣品中添加1.0 μg/kg、3.0 μg/kg、10.0 μg/kg

3個濃度水平的赭曲霉毒素A標準溶液，進行方法回收率和精密度試驗，測定結果見表1。

由表1可見，赭曲霉毒素A的回收率在80.33%～97.20%，相對標準偏差為3.44%～7.22%，符合GB/T 27404—2008中檢測方法確認的要求。

3 結論

對餅干進行前處理，然后采用高效液相色譜法對赭曲霉毒素A進行測定，從而建立了餅干中赭曲霉毒素A測定的檢測方法。本方法簡便準確，實用性強，可為餅干中赭曲霉毒素A風險監測提供可靠的技術支持。

參考文獻

[1]Petzinger E，Ziegler K.Ochratoxin A from a toxicological perspective[J].J Vet Pharm Ther，2010，23（2）：91?98.

[2]Reddy L，Bhoola K.Ochratoxins-food contaminants：impact on human health [J].Toxins，2010（2）：771-779.

[3]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.

[4]呂相征，謝妮，李業鵬，等.用高效液相色譜法測定糧食樣品中的赭曲霉毒素A[J].中國醫科大學學報，2002（4）：47-48.

[5]樊祥，禇慶華，周瑤，等.液-液萃取結合免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜測定烘焙咖啡中赭曲霉毒素A[J].理化檢驗（化學分冊），2008（8）：736-739.

[6]楊超，林洪，張輝珍，李惠潁.免疫親合柱凈化高效液相色譜檢測啤酒中赭曲霉毒素A[J].食品與發酵工業，2007（12）：127-129.