睡眠剝奪聯合氟西汀對抑郁模型大鼠行為及血清促腎上腺皮質激素、皮質酮的影響

菊軒　　時雯雯　陳松　　胡希文　董介正　　朱春燕

[關鍵詞] 睡眠剝奪;氟西汀;抑郁;促腎上腺皮質激素;皮質酮

[中圖分類號] R852.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）16-0043-05

Effects of sleep deprivation combined with fluoxetine on behavior and serum adrenocorticotropic hormone and corticosterone in depression model rats

JU Xuan1? ?SHI Wenwen2? ?CHEN Song1? ?HU Xiwen1? ?DONG Jiezheng1? ?ZHU Chunyan1

1.The Sixth Department of Psychiatry， Hangzhou Seventh People′s Hospital， Hangzhou 310013， China; 2.Department of Science and Education， Hangzhou Seventh People′s Hospital， Hangzhou? ?310013， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of sleep deprivation combined with fluoxetine on behavior， serum adrenocorticotropic hormone（ACTH） and corticosterone（CORT） in depression model rats and its possible mechanism. Methods Sixty adult SD male rats were divided into the normal control group （10 rats） and the stress model group （50 rats）.The stress model group underwent 21 days of chronic mild unpredictable stress（CMUS）， forced swimming test and sucrose water consumption test. Afterwards， the rats were randomly divided into the depression group， the fluoxetine group， the normal saline group， the sleep deprivation group， and the sleep deprivation + fluoxetine group. They were given single cage， fluoxetine for gavage， normal saline for gavage， 72-hour REM sleep deprivation，72-hour REM sleep deprivation combined with fluoxetine gavage， respectively. 28 days later，forced swimming test and sucrose water consumption test were performed again， and the concentrations of ACTH and CORT in rat serum were determined by ELISA. Results After stress， the immobility time of rats was significantly longer in the stress model group than that in the normal control group，with statistically significant difference（P<0.05）， and the sucrose water consumption and sucrose water preference of rats were significantly lower in the stress model group than those in the normal control group， with statistically significant differences（P<0.05）. The forced swimming immobility time of rats was significantly lower in the sleep deprivation combined with fluoxetine group than that before treatment， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Sucrose water consumption and sucrose water preference were significantly higher in the sleep deprivation combined with fluoxetine group than before， and the differences were statistically significant（P<0.05）. After 28 days of treatment，the levels of ACTH and CORT were significantly lower in the fluoxetine group， the sleep deprivation group and the sleep deprivation+fluoxetine group than those in the depression group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Sleep deprivation combined with fluoxetine can improve depressive behavior of depression model rats， and its mechanism may be related to the reduction of ACTH， CORT levels and HPA axis activity.

[Key words] Sleep deprivation; Fluoxetine; Depression; Adrenocorticotropic hormone; Corticosterone

抑郁癥是一個全球性嚴峻的臨床和社會問題，是最常見的精神障礙之一，是以持續情緒低落、愉快感缺失、興趣喪失、思維及認知遲緩等癥狀為臨床表現的疾病。抑郁癥的自殺死亡率約是普通人群的20倍[1]，WHO已將其列為醫療負擔最重的疾病[2]。在我國30個省市進行的最新精神疾病流行病學調查顯示，抑郁障礙的年患病率為6.8%，且患病率較前增加明顯[3]。雖然新型抗抑郁藥物得以廣泛地使用，但仍有20%～30%的患者對于藥物治療沒有良好的應答，或出現難以耐受的不良反應[4]，且伴隨嚴重的自傷、自殺風險。目前的抑郁癥治療手段中，睡眠剝奪可以在24 h內即可觀察到較為顯著的效果，安全性佳，且沒有明顯的禁忌證和副反應[5];整夜睡眠剝奪及睡眠時相提前可明顯改善難治性抑郁患者的藥物療效[6]。但是睡眠剝奪的快速抗抑郁機制仍不明確。隨著生物技術的發展，越來越多的研究表明下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸的過度活躍是抑郁癥重要的病理生理學表現[7]。HPA軸的負反饋調節受大腦、腺垂體激素的共同影響。下丘腦室旁核釋放促腎上腺皮質激素釋放激素（Corticotropin releasing hormone，CRH），經過垂體門脈系統到達并刺激垂體，后者分泌促腎上腺皮質激素（Adrenocorticotrophic hormone，ACTH），ACTH經血液循環達到腎上腺皮質，分泌大量糖皮質激素（Glucocorticoid，GC），在人體主要是皮質醇，在嚙齒類動物主要是皮質酮（Corticosterone，CORT）;同時GC作用于下丘腦和垂體，減少ACTH的釋放并阻斷其興奮性，形成HPA軸的負反饋調節[8]。本實驗旨在通過快眼動睡眠剝奪（Rapid eye movement sleep deprivation，REMSD）聯合SSRI類抗抑郁藥物氟西汀作用于抑郁模型大鼠，觀察大鼠的行為及血清ACTH、CORT濃度的變化，探討睡眠剝奪聯合抗抑郁藥物對抑郁模型大鼠的抗抑郁療效和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級成年健康SD大鼠60只，雄性，體重230～260 g，上海吉輝實驗動物飼養有限公司提供，動物合格證號：SCXK（滬）2017-0012。實驗前在實驗室環境下適應性合籠飼養1周。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸氟西汀片（Fluoxetine hydrochloride tablets，禮來蘇州制藥有限公司，國藥準字J20160029，規格：20 mg×28片），血清ACTH、CORT的ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所），酶標儀（Bio-rad imark），動物運動軌跡跟蹤系統（EthoVision XT 13），高速離心機（Thermo X1R），大鼠睡眠剝奪箱。

1.3 動物分組及實驗流程

實驗大鼠隨機分為正常對照組（10只）和應激模型組（50只），對每只大鼠進行第一次強迫游泳實驗和蔗糖水消耗實驗。正常對照組予以單籠孤養，不進行任何刺激。應激模型組行21 d慢性輕度不可預見性應激（Chronic mild unpredictable stress，CMUS），并進行第2次強迫游泳實驗和蔗糖水消耗實驗，采用隨機分組的方法把應激模型組大鼠分為五組并繼續行CMUS，抑郁組、氟西汀組、生理鹽水組、睡眠剝奪組、睡眠剝奪+氟西汀組每組10只。抑郁組予以單籠孤養。氟西汀組予以氟西汀灌胃劑灌胃給藥，根據人體和大鼠體表面積換算的等效劑量，氟西汀灌胃劑為4 mg/kg（相當于60 kg體重的成年人40 mg/d劑量攝入），1次/d，持續28 d。生理鹽水組予以生理鹽水灌胃每只大鼠1.5 mL，1次/d，持續28 d。睡眠剝奪組在第1、8、15、22天進行72 h REMSD。睡眠剝奪+氟西汀組在第1、8、15、22天進行72 h REMSD同時持續28 d氟西汀灌胃劑灌胃給藥，1次/d（劑量換算方法同前）。第28天對應激模型組行第三次強迫游泳實驗和蔗糖水消耗實驗，并對全部六組大鼠分別進行斷頭，留取血液標本。

1.4 方法

1.4.1 慢性輕度不可預見性應激模型? 大鼠在連續21 d內每天隨機采取以下一種方式進行刺激。包括：①禁食24 h;②冰水游泳（4℃、5 min）;③45°傾斜鼠籠;④晝夜顛倒;⑤夾尾1 min;⑥禁水24 h;⑦高溫震蕩（40℃、50 Hz）;⑧行為限制2 h;⑨濕籠10 h。在整個過程中每種刺激平均出現2～3次，同種刺激不連續出現，使大鼠不能預料刺激的發生。

1.4.2 強迫游泳實驗? 將大鼠放入透明有機玻璃缸中（高50 cm，直徑25 cm）進行強迫游泳實驗，水溫保持在25℃左右，時間固定在每天3：00～5：00 pm，室內保持安靜、自然光線，實驗時間5 min。使用動物運動軌跡跟蹤系統錄像并分析大鼠5 min內的不動時間。不動時間定義：呈現不掙扎、漂浮狀態，或僅有肢體的細小運動以保持頭部浮于水面的時間。

1.4.3 蔗糖水消耗實驗? 實驗開始前訓練所有大鼠選擇和適應蔗糖水，第1天同時給予大鼠2瓶1%蔗糖水讓大鼠飲用;第2天則1只水瓶裝1%蔗糖水另1個瓶裝純水。正式實驗時先使大鼠禁食禁水21 h，每只大鼠接受提前稱好的2瓶水，1瓶為1%蔗糖溶液，1瓶為純水，3 h后分別稱重2瓶水，計算蔗糖水和純水的消耗量。蔗糖水偏好=蔗糖水消耗總量/[糖水消耗總量+純水消耗總量]×100%。

1.4.4 快眼動睡眠剝奪模型? 選用塑料水桶（尺寸38 cm×36 cm×40 cm），中央部固定安置高8 cm、直徑6 cm的圓形平臺，加水至臺下1 cm。大鼠站在平臺上能夠進食、進水，當進入快速動眼睡眠期，由于全身肌肉張力降低而節律性觸水或落水，由于對水環境的恐懼，大鼠會迅速爬上平臺，使其始終不能進入REM睡眠期，從而完成了大鼠的快速動眼睡眠剝奪。睡眠剝奪期間予以持續燈光照射，水糟中的水每天更換，室溫保持在22℃左右。

1.4.5 促腎上腺皮質激素、皮質酮濃度的測定? 實驗結束后大鼠斷頭取血，高速離心機離心5 min（3000 r/min），吸取上層血清，-80℃冰箱保存。血清ACTH、CORT采用ELISA法檢測，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。按照ELISA試劑盒說明操作，用酶標儀檢測波長450 nm處吸光度值（OD值），根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，計算出各組大鼠血清相應的ACTH、CORT濃度。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行處理分析。計量資料以均數±標準差（x±s）的形式表示，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，自身前后比較采用配對樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（one way ANOVA）對各指標數據進行組間均數比較，多組數據組內兩兩比較時采用LSD檢驗（通過方差齊性檢驗）和Dunnett T3檢驗（未通過方差齊性檢驗），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性輕度應激前后大鼠強迫游泳實驗不動時間比較

應激刺激前，正常對照組與應激模型組強迫游泳漂浮不動時間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。21 d應激刺激后，應激模型組漂浮不動時間比應激前顯著延長，差異有統計學意義（P<0.05）。21 d應激刺激后，應激模型組漂浮不動時間顯著長于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 慢性輕度應激前后蔗糖水消耗實驗結果比較

應激刺激前，正常對照組與應激模型組蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好比較，差異無統計學意義（P>0.05），21 d應激刺激后，應激模型組蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好相比應激前明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。21 d應激刺激后，應激模型組相比正常對照組蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 睡眠剝奪及氟西汀應激前后強迫游泳實驗結果比較

應激前，各組大鼠強迫游泳漂浮不動時間比較，差異無統計學意義（P>0.05）;應激后各組大鼠強迫游泳漂浮不動時間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。氟西汀應激后大鼠強迫游泳不動時間較應激前顯著縮短，差異有統計學意義（P<0.05）;相比抑郁組，氟西汀組強迫游泳不動時間明顯縮短，差異有統計學意義（P<0.05）。睡眠剝奪組相比抑郁組強迫游泳不動時間較前顯著縮短，差異有統計學意義（P<0.05）;睡眠剝奪組行睡眠剝奪后強迫游泳不動時間顯著低于應激前，差異有統計學意義（P<0.05）。睡眠剝奪+氟西汀組強迫游泳不動時間降低，差異有統計學意義（P<0.05）;睡眠剝奪+氟西汀組強迫游泳不動時間較應激前明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 睡眠剝奪及氟西汀應激前后蔗糖水消耗實驗結果比較

應激前，各組大鼠蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好比較，差異無統計學意義（P>0.05）;應激后各組大鼠蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好比較，差異有統計學意義（P<0.05）。應激后28 d，氟西汀組蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好較前顯著升高（P<0.05）;氟西汀組蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好比抑郁組顯著升高（P<0.05）。睡眠剝奪組蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好較應激前顯著升高（P<0.05）;睡眠剝奪組大鼠蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好比抑郁組顯著升高（P<0.05）。睡眠剝奪+氟西汀組大鼠蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好顯著高于應激前（P<0.05）;睡眠剝奪+氟西汀組大鼠蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好相比抑郁組顯著升高（P<0.05）。見表4。

2.5 應激后各組血清ACTH、CORT水平比較

造模后抑郁組ACTH、CORT水平顯著高于正常對照組，差異有統計學意義（t=4.714、7.583，P<0.05）。應激后28 d，氟西汀組ACTH、CORT水平顯著低于抑郁組，差異有統計學意義（t=7.932、8.073，P<0.05）;睡眠剝奪組ACTH、CORT水平顯著低于抑郁組，差異有統計學意義（t=5.347、6.416，P<0.05）;睡眠剝奪+氟西汀組ACTH、CORT水平顯著低于抑郁組，差異有統計學意義（t=4.951、9.506，P<0.05）;睡眠剝奪+氟西汀組ACTH、CORT水平顯著低于氟西汀組，差異有統計學意義（t=4.697、9.077，P<0.05）;睡眠剝奪+氟西汀組ACTH、CORT水平顯著低于睡眠剝奪組，差異有統計學意義（t=3.540、6.487，P<0.05）。見表5。

3 討論

抑郁癥反復發作給患者及其家庭、社會帶來極大影響，并造成極大的經濟負擔。對于抑郁癥最普遍的治療手段仍然是抗抑郁藥物，但其臨床療效仍需要數周時間才能充分體現[9]。抗抑郁藥物的副作用如焦慮、緊張不安、食欲下降、惡心嘔吐、疲勞及性功能紊亂等嚴重影響治療的依從性。早期的臨床療效對于遠期的治療結果也起到重要的作用，故對于睡眠剝奪快速抗抑郁機制的研究尤為重要。

CMUS聯合孤養模式建立的抑郁癥動物模型是目前比較常用的動物模型。該模型將不同強弱的應激刺激安排在不同的時間，模擬抑郁癥患者遭遇的各種不同應激事件及產生的絕望無助感，目前已被廣泛運用于抑郁癥機制的研究[10]。強迫游泳實驗是使大鼠在有限空間里游泳而無法逃脫，其不動時間反映了大鼠的絕望無助感;蔗糖水消耗實驗則反映了大鼠的快感缺失水平[11]。本實驗結果顯示，經過8 d CMUS后，應激模型組大鼠強迫游泳不動時間顯著長于正常對照組，蔗糖水消耗量、蔗糖水偏好顯著低于正常對照組，提示本實驗抑郁造模成功。

睡眠剝奪對于40%～60%的抑郁癥患者能夠發揮快速抗抑郁作用，但是這種作用并不持久[12];目前很多方法都在探討如何避免睡眠恢復后病情的復發[13]。本實驗在大鼠造模成功后繼續行慢性應激刺激，在應激28 d內的第1天、第8天、第15天、第22天進行72 h REMSD。本實驗中，強迫游泳及蔗糖水實驗結果提示睡眠剝奪組大鼠比抑郁模型組大鼠抑郁樣行為有明顯的改善，可見短期內增加睡眠剝奪的次數可以明顯提高睡眠剝奪抗抑郁的效應，這與部分實驗結果一致[14]。

本研究發現睡眠剝奪治療后，大鼠的抑郁樣行為的改善與單獨使用氟西汀治療效果相當，睡眠剝奪聯合氟西汀治療對大鼠行為學改善更為顯著。這種協同作用可能是由于睡眠剝奪能夠增加所有抗抑郁藥物作用的靶系統遞質水平，如五羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）[15];另外研究發現睡眠剝奪還可以增加去甲腎上腺素的突觸表達、酪氨酸羥化酶以及藍斑核的NE轉運蛋白的水平[16]，進而產生抗抑郁作用。

在持續的應激狀態下可導致機體HPA軸的過度亢進，產生過多的ACTH和CORT[17]。海馬是調節情緒重要的腦區并且富含糖皮質激素受體（Glucocorticoid receptor，GR），過多糖皮質激素與海馬部位GR結合后導致海馬的損傷;而這一效應使海馬對HPA軸的抑制作用減弱，進而產生更多的GC[18]。在本實驗中抑郁組大鼠ACTH和CORT水平顯著高于正常對照組，這與部分實驗結果[19]一致，經氟西汀藥物治療后水平明顯下降。

本實驗中，睡眠剝奪組ACTH和CORT水平較抑郁組明顯降低，當與氟西汀聯合使用后二者的水平進一步下降，并且大鼠抑郁樣行為有所改善;在其他實驗中整夜睡眠剝奪可產生明顯的抗抑郁效用的同時也伴隨血清GC水平明顯降低[20-21]，這提示快眼動睡眠剝奪聯合SSRI類抗抑郁藥物使用后對HPA軸有明顯的抑制作用，而且這與睡眠障礙的HPA軸輕度喚醒是不同的。然而有文獻提示睡眠剝奪可導致HPA軸短暫激活[22]，這可能與夜間視交叉上核（SCN）活動產生的皮質醇覺醒反應有關[20]。

綜上所述，睡眠剝奪聯合氟西汀可以促進抑郁模型大鼠抑郁樣行為的改善，可能主要通過降低ACTH和CORT水平，抑制HPA軸的活性發揮其作用;同時在研究睡眠剝奪抗抑郁機制時需要更多關注生物穩態和糖皮質激素水平的變化。

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（收稿日期：2020-11-18）