基于高通量測序技術的牡蠣殼粉緩解骨質疏松癥的研究

石秋月，侯付景，韓姣姣，李菁菁，陳 菊，蘇秀榕,

（1.寧波大學農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室，浙江寧波 315211；2.寧波大學食品與藥學學院，浙江寧波 315832；3.寧波綠之健藥業有限公司，浙江寧波 315505；4.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315832）

糖皮質激素性骨質疏松（glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP）屬于繼發性骨質疏松，是一種因內源或外源糖皮質激素所致的、以骨強度下降、骨折風險性增加為特征的代謝性骨病[1]。地塞米松是一種強效合成糖皮質激素，它能顯著降低成骨細胞數量和骨形成率，同時增加骨吸收和破骨細胞壽命，最終導致糖皮質激素性骨質疏松癥的發生[2?3]。腸鈣吸收減少是糖皮質激素性骨質疏松癥發病的重要機制，需要補充大量的鈣劑，以促進骨骼的構建[4]。雙膦酸鹽廣泛用于預防或治療骨質疏松癥，其抑制骨吸收形成的同時也會對骨正常礦物化造成影響，增加類骨質，加大骨折產生風險，還能產生胃腸不耐癥和下頜骨壞死等副作用[5?6]。因此，需要尋找更加安全的鈣劑來治療骨質疏松癥。

牡蠣屬于軟體動物門、雙殼綱、牡蠣目、牡蠣總科、牡蠣科，全世界牡蠣共有100多種，我國沿海有20多種，分布廣泛，是中國四大養殖貝類之一，現入藥的牡蠣主要有近江牡蠣、長牡蠣和大連灣牡蠣[7?8]。牡蠣殼含鈣量豐富，經特殊處理后更容易被人體吸收，是良好的天然生物鈣源[9]。通過高溫煅燒達到離子化狀態且經超微粉碎的牡蠣鈣更容易被人體吸收利用，同時牡蠣中多種微量元素及氨基酸還能反過來促進鈣的吸收[10]。此外，牡蠣鈣對口腔癌的發生具有抑制作用[11]。有研究表明，以牡蠣殼為原料制備的L-天冬氨酸螯合鈣可以通過上調血清OPG含量和下調RANKL含量來顯著增強生物力學性能和骨骼質量，調節骨骼代謝，從而減少骨鈣流失，并使骨質疏松性骨恢復為更健康的骨組織結構，具有更好的改善效果[12]。有越來越多的研究表明腸道菌群及其代謝產物也可通過影響鈣吸收、調節免疫反應、參與雌激素代謝發揮促進成骨抑制破骨等作用影響骨代謝[13]。但是，牡蠣殼粉緩解糖皮質激素性骨質疏松的過程中是否會導致菌群變化，卻沒有相關研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用牡蠣殼 由寧波今日食品有限公司提供；實驗用雌性小鼠 購自浙江省實驗動物中心，合格證號：SCXK（浙）2014-0001（編號：1704050008）；常規飼料 購于寧波大學實驗動物中心；總鈣、堿性磷酸酶（ALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）測定試劑盒 購于南京建成生物工程研究所；TransZol Up Plus RNA試劑盒（ER501）和TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR

試劑盒（AT341） 北京全式金生物技術有限公司；其他化學試劑 均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

PM-100超微球磨機 德國Retsch GmbH公司；Microtrac S3500激光粒度分布儀 美國Microtrac公司；Elan5000電感耦合等離子體質譜儀 美國Perkin-ElmerSciex公司；eXplore Locus微計算機斷層掃描儀 美國GE Healthcare公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣殼粉的制備及粒徑分布的測定 牡蠣殼去除表面附著的泥沙和雜物后，用馬弗爐于300 ℃煅燒8 h，冷卻后用超微球磨機研磨成細顆粒，經100目不銹鋼篩網過篩獲得牡蠣殼粉（oyster shell powder，OSP），其粒徑分布（particle size distribution）利用上海交通大學分析測試中心提供的激光粒度分布儀測定，平均粒徑采用中位粒徑（D50）表示。

1.2.2 礦物質元素的測定 取0.5 g牡蠣殼粉放入四氟乙烯密封的消解管中，加入5 mL HNO3（65%），將消解管置于微波消解儀，消解5 h直至無色透明，用超純水定容消化后的樣品至25 mL。然后，利用電感耦合等離子體質譜儀測定。

1.2.3 動物實驗 將20只ICR雌性小鼠（22.81±1.53 g）隨機分成4個處理組，分別是對照組、模型組、碳酸鈣組和牡蠣殼粉組。除對照組小鼠肌肉注射生理鹽水，其余組小鼠每只肌肉注射（1 mg/kg/d）地塞米松，每2 d一次。同時，對照組和模型組中的小鼠灌胃生理鹽水；根據鈣的推薦攝入量[14]，碳酸鈣組和牡蠣殼粉組接受相同劑量的鈣水平，為227.5 mg/kg/d。動物實驗在恒溫（25 ℃）環境下共飼養10周，12 h光照/12 h黑暗循環，所有小鼠都可以自由獲取食物和飲用水。在實驗結束之前，收集每只小鼠的糞便保存在?80 ℃用于16S rRNA基因測序。動物實驗結束后，眼眶取血，4 ℃，3000 r/min離心15 min制備血清。

1.2.4 骨組織CT掃描 利用微計算機斷層掃描儀，對小鼠進行股骨掃描、骨骼三維重建以及骨密度指標分析來評估骨量和微結構的變化。使用GEHC micro view 2.2軟件進行三維重建、骨密度及骨小梁結構分析，并使用骨密度（Bone mineral density，BMD）、骨小梁厚度（Trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分離度（Trabecular bone separation，Tb.Sp）和結構模型指數（Structural model index，SMI）等參數表示。

1.2.5 生理生化檢測 血清鈣（calcium，Ca）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP）含量按照試劑盒說明書進行。

圖2為添加了高斯白噪聲的信號波形圖,信噪比SNR=-20。當信號覆蓋在大量噪聲下時很難通過簡單的濾波方法進行信號提取或者簡單的鎖相環方法進行相位鎖定。

1.2.6 熒光定量PCR 用TransZol Up Plus RNA試劑盒提取總RNA，利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒合成cDNA。以β-actin作為內參基因，利用Rotor-Gene 6000對cDNA分別進行目的基因和內參基因的擴增，利用標準曲線由檢測儀自動計算出Ct值，并利用2-ΔΔCt法進行相對定量分析[15?16]。利用Primer 5軟件進行設計引物，具體引物信息如表1。

表 1 基因引物序列（5'→3'）Table 1 Target genes primer sequence (5'→3')

1.2.7 腸道微生物的高通量測序 利用QIAamp DNA Stool Mini提取試劑盒抽提糞便DNA，對16S rRNA可變區（V3+V4）進行PCR擴增。使用Illumina MiSeq測序儀進行2×300 bp的雙端測序。分別使用QIIME 1.8.0，Mothur 1.30.1和Userach 7.1進行原始測序讀數的預處理，α和β多樣性的計算以及OTU的生成，采用RDP classifier軟件對處理后的序列進行物種分類、群落變化的分析[17?19]。通過Spearman相關性分析計算優勢菌種和骨轉換標記物之間的相關性。P<0.05和false discovery rate <0.25被定義為具有顯著相關性。

1.3 數據分析

所有數據均采用SPSS19.0統計分析，采用平均值±標準差的方式表示。符合正態分布的數據采用ANOVA和Tukey’s post hoc test進行分析，不符合方差分析特征的數據采用Mann-Whitney test。P<0.05表示在統計學意義上具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 牡蠣殼粉粒徑及礦物質含量

經300 ℃馬弗爐煅燒8 h后，經一系列處理得到牡蠣殼粉的粒徑分布圖如圖1所示，峰兩側粗細粒徑的百分比含量互相對應地減少，形成以峰為對稱軸的對稱曲線。牡蠣殼粉以24.92 μm中位粒徑為中心的單峰分布（圖1）且牡蠣殼粉中Ca含量36.90 g/kg（表2）。

圖 1 牡蠣殼粉的粒徑分布圖Fig.1 Particle size distribution of OSP

表 2 牡蠣殼粉的礦物質元素組成Table 2 Mineral composition of OSP

2.2 骨組織形態計量學變化

通過微計算機斷層掃描儀（Micro CT）對各組實驗小鼠的骨頭進行觀察（圖2）；并通過GEHC micro view 2.2軟件計算出骨密度、骨小梁結構等骨組織形態計量學的微觀參數（圖3）。與對照組相比，模型組的骨密度（BMD）、骨小梁厚度（Tb.Th）均顯著減小（P<0.05）；且骨小梁分離度（Tb.Sp）和結構模型指數（SMI）均顯著增加（P<0.05），糖皮質激素使小鼠骨量流失并使骨小梁區域的骨組織受損，這說明造模成功。經碳酸鈣和牡蠣殼粉治療后，四個指標均發生變化，且牡蠣殼粉組顯著增加了骨密度和骨小梁厚度（P<0.05）。

圖 2 小鼠的骨股micro CT圖像Fig.2 Micro CT images of the femur in mice

圖 3 小鼠骨組織形態計量學指標Fig.3 Bone tissue morphology index in mice

2.3 生理生化指標

2.3.1 鈣含量 鈣是骨吸收的指標。與對照組相比，模型組中血清鈣（1.22±0.10 mg/kg）、糞便鈣（30.30±3.64 mg/kg）含量顯著升高（P<0.05）；股骨鈣的含量降低（116.26±18.24 mg/kg，P>0.05）。與模型組相比，經牡蠣殼粉組的處理后血清鈣（0.92±0.07 mg/kg，P<0.001）和糞便鈣（29.14±1.97 mg/kg，P>0.05）均降低；股骨鈣含量增加（129.06±17.81 mg/kg，P>0.05），牡蠣殼粉組與碳酸鈣組的股骨鈣含量較為相近，與物理指標中的骨密度（BMD）的結果一致（表3）。

表 3 小鼠各部分的鈣量變化Table 3 Changes in the amount of calcium in each part of mice

2.3.2 骨轉換標志酶的變化 骨轉換標志物是一些骨骼重建過程中，存在于血液或尿液中的產物，可用于評價骨吸收（ALP）和骨形成（TRACP）是否正常。與對照組相比，模型組中血清ALP的酶活顯著降低（42.16±2.56 U/L，P<0.05），TRACP的酶活顯著上升（17.69±0.44 U/L，P<0.01）。與模型組相比，經牡蠣殼粉組處理后ALP的酶活顯著上升（66.29±1.15 U/L，P<0.001），TRACP的酶活顯著下降（14.55±0.69 U/L，P<0.01）（圖4）。

圖 4 小鼠的骨轉換標記物的酶活Fig.4 Enzyme activity of bone turnover markers in mice

2.4 骨轉換標記物相關基因表達

與對照組相比，糖皮質激素的處理使ALP和OPG基因的轉錄水平顯著下調（0.24±0.03、0.63±0.08，P<0.01）；而使TRACP和Sclerostin基因的轉錄水平顯著上調（1.96±0.15、1.53±0.07，P<0.01、P<0.05）。經過牡蠣殼粉和碳酸鈣治療后骨轉換指標均不同程度逆轉（圖5）。

圖 5 小鼠的骨轉換標記物相關基因表達Fig.5 Gene expression related to bone turnover markers in mice

2.5 腸道菌群組成和結構的變化

2.5.1 Alpha多樣性 Chao1指數和Shannon指數用于評估腸道菌群的物種豐富度和多樣性。Chao1指數和Shannon指數越高表明樣品物種豐富度和多樣性越高，如圖6所示，模型組的物種豐富度和多樣性均顯著低于對照組（P<0.05），經過牡蠣殼粉治療后能顯著增加腸道微生物的豐富度和多樣性（P<0.05）。

圖 6 小鼠腸道菌群Chao1指數及Shannon指數Fig.6 Chao1 index and Shannon index of gut microbiota in mice

2.5.2 Beta多樣性的差異 Beta多樣性是指不同環境群落之間的物種差異性。如圖7所示，經過糖皮質激素造模10周后，腸道菌群結構偏離了對照組。在此基礎上，牡蠣殼粉和碳酸鈣治療均可調節腸道菌群結構，使小鼠的腸道菌群結構發生不同程度的改變。

圖 7 各組小鼠的PCoA圖Fig.7 PCoA of each group of mice

2.5.3 種群的組成變化 桑基圖用來展示數據的“流動”變化，分支的寬度表示流量的大小。圖8顯示了不同樣本對應的門水平和種水平的菌群相對豐度。基于相對豐度>2%的原則，從4組中共篩選出9個優勢菌種，包括Christensenella massiliensis、產糞甾醇真細菌（Eubacterium coprostanoligenes）、K.alysoides、嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）、動物乳桿菌（Lactobacillus animalis）、糞便乳桿菌（Lactobacillus faecis）、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）、Muribaculum intestinale、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides distasonis），其中M.intestinale和狄氏副擬桿菌屬于擬桿菌門（Bacteroidetes），而C.massiliensis、產糞甾醇真細菌、K.alysoides、嗜酸乳酸桿菌、動物乳桿菌、糞便乳桿菌和約氏乳桿菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）。與對照組相比，模型組的動物乳桿菌、糞便乳桿菌、約氏乳桿菌、產糞甾醇真細菌和K.alysoides的相對豐度降低，而M.intestinale、狄氏副擬桿菌、嗜酸乳酸桿菌和C.massiliensis的相對豐度升高。與模型組相比，牡蠣殼粉和碳酸鈣治療組的C.massiliensis、動物乳桿菌、糞便乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌和狄氏副擬桿菌的相對豐度降低，而約氏乳桿菌、產糞甾醇真細菌、K.alysoides和M.intestinale的相對豐度升高。

圖 8 小鼠腸道菌群門和種的變化趨勢Fig.8 Changes in the phyla and species of mice gut microbiota

不同組小鼠腸道微生物群落結構各不相同，通過Cytoscape圖分析小鼠腸道微生物發現，在所有組中共檢測出509個OTUs，分別是厚壁菌門（Firmicutes，48.72%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，44.60%）、變形菌門（Proteobacteria，3.73%）和放線菌門（Actinobacteria，1.77%）。對照組、模型組、碳酸鈣組和牡蠣殼粉組中分別有78、31、68和118個特有的OTUs（圖9）。

圖 9 每組小鼠特有的OTUsFig.9 Specific OTUs to each group of mice

2.6 關聯性分析

為了研究腸道微生物的種與骨轉換標記物的關系，經冗余分析（RDA）篩選50個豐度差異較大的種，與骨轉換標記物進行Spearman’s相關性分析。結果表明，有16個菌種與至少一個骨轉換標記物存在顯著相關（P<0.05）。其中與骨形成標記物成正相關的菌種有2種，是Anaerobacterium chartisolvens和Millionella massiliensis，而這兩種菌與骨吸收標志物顯著負相關。另有10種菌與骨形成標志物顯著負相關，分別是C.massiliensis、嗜酸乳酸桿菌、豚鼠乳桿菌（Lactobacillus caviae）、費氏埃希菌（Escherichia fergusonii）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri）、Turicibacter sanguinis、產酸擬桿菌（Bacteroides acidifaciens）、Anaerobium acetethylicum、產液阿德勒克羅伊茨菌（Adlercreutzia equolifaciens）和Butyricimonas synergistica，而除產液阿德勒克羅伊茨菌外，其他9種菌與骨吸收標記物顯著正相關（圖10）。

圖 10 小鼠腸道菌群優勢菌種與骨轉換標記物的相關性分析Fig.10 Correlation analysis of dominant species of gut microbiota and bone turnover markers in mice

3 討論與結論

骨組織是一個動態變化的器官，它的強度和結構是由成骨細胞和破骨細胞進行調節的，若骨吸收增加而骨形成減少，將導致骨丟失或骨質疏松癥的發生[3]。骨質疏松導致骨小梁數量減少、厚度減少，骨小梁之間的分離度增大、相互連接結構被打亂，從而增加骨折的風險[20?21]。本文證明了注射糖皮質激素后，模型組中的小鼠骨量明顯減小，骨小梁連接密度減小，骨小梁結構受損。而經牡蠣殼鈣治療后，BMD和Tb.Th升高、Tb.Sp和SMI降低，說明牡蠣殼粉能改善骨微結構。骨轉換標志物是主要的骨組織代謝產物，通過骨骼重建將其釋放到血液和尿液中，主要包括骨形成標志物以及骨吸收標志物[22]。而ALP和OPG是骨形成標記物[23]；TRACP和Sclerostin是骨吸收標記物[24]。在本研究中糖皮質激素能顯著降低血清中ALP的酶活（P<0.05），而顯著升高了TRACP的酶活（P<0.01）；經牡蠣鈣治療后，血清中ALP和TRACP的酶活均恢復了且接近于對照組。與對照組相比，模型組中股骨ALP水平與OPG呈顯著正相關，與sclerostin呈負相關；而TRACP水平與OPG呈顯著負相關，與sclerostin呈正相關，說明糖皮質激素破壞骨骼生長重塑，經過牡蠣殼粉的處理，這些指標得到不同程度的改善。

人類腸道中存在著多達100萬億個腸道微生物或腸道菌群，其中絕大多數是對人體健康至關重要的非致病菌[25]。有研究發現無菌小鼠骨量高于正常小鼠、骨礦物質密度和骨體積分數增加，并且骨吸收標記物的含量降低，說明腸道菌群對骨代謝具有調控作用[26?27]。腸道微生物可能通過影響B細胞產生的骨保護素（OPG）來改變骨吸收[28]。隨著年齡增長，骨質疏松癥患病率逐漸增加，腸道菌群結構也隨之發生變化，致病性變形菌門和桿菌門比例增加，而具有抗炎作用乳酸桿菌比例下降，這些改變可能影響了骨代謝，增加骨質疏松發生風險[29]。在本研究中，模型組的乳桿菌相對豐度下降。有研究表明糖皮質激素誘導的雌激素缺乏使表征腸道菌群豐富度和多樣性降低[30]，而經牡蠣殼粉處理后，腸道菌群的豐富度和多樣性顯著增加。羅伊氏乳桿菌產生酸性環境，從而抑制有害微生物的生長和繁殖，可有效避免沙門氏桿菌的感染，并幫助維持腸道菌群的正常化[31?32]。在本研究中，羅伊氏乳桿菌與骨形成標記物顯著正相關，與骨吸收標記物顯著負相關。腸道微生物群是一個信號中樞，通過將環境（如飲食）和遺傳因素與免疫信號結合起來，從而達到影響宿主的健康和疾病的變換過程[33]。羅伊氏乳桿菌可以通過發酵產生短鏈脂肪酸（SCFAs），它是體內破骨細胞代謝和骨量的調節劑，它可以增加鈣的吸收和運輸，刺激腸源性血清素的生物合成，并直接抑制破骨細胞的分化和骨吸收[8,34]。牡蠣殼鈣對糖皮質激素性骨質疏松的緩解作用可能也與SCFAs有關。

牡蠣殼粉能改變小鼠股骨的微觀結構、抑制骨礦物質流失、減少骨的丟失，降低血清鈣的含量、促進骨形成標記基因的表達而抑制骨吸收標志基因的表達；同時還能影響腸道微生物的α、β多樣性和菌群組成，從而有效地緩解糖皮質激素性骨質疏松癥。