姜黃素超分子包合物對乙醇誘導LO2細胞損傷的保護作用

范土貴，陳建平, ，高加龍，鐘賽意，秦小明

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研究中心，廣東省海洋生物制品工程實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東省亞熱帶果蔬加工科技創新中心，廣東湛江 524088；2.大連工業大學，海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧大連 116034）

眾所周知，肝臟是人體重要代謝器官，能將不利于體內代謝的物質轉化為無毒物質排出體外[1]。長期飲酒及過量飲酒會對人體肝臟造成傷害，導致酒精性肝損傷繼而在嚴重情況下引發肝癌[2]。因此，如何有效地保護肝臟免受酒精的損傷從而預防肝癌的發生成為目前醫藥和食品領域研究的熱點。近年來，具有低毒副作用、多途徑、多靶點作用的天然產物如黃酮類和多酚類等備受關注。研究發現，這類天然產物能夠通過提高肝臟組織的抗炎癥反應、抗氧化應激和抗細胞凋亡的能力以及調節脂質代謝、乙醇代謝和腸道微生物等途徑改善肝損傷，從而保護肝臟組織[3]。

姜黃素是一種從姜科植物根莖中提取得到的脂溶性多酚類物質[4]。作為一種食品添加劑，姜黃素廣泛應用于糕點、罐頭、飲料等食品中[5]。研究發現，姜黃素具有很好的護肝效應，可降低酒精、四氯化碳、硫代乙酰胺等各種化學藥物引起的肝損傷[6?9]。進一步的機理研究表明，姜黃素通過能夠上調Nrf2-ARE信號通路中Nrf2蛋白的表達量來保護肝臟[10?11]。因此，姜黃素具有較好的應用前景。然而，姜黃素的水溶性差及生物利用度低限制了它在酒精性肝損傷防治方面的應用。為此本課題組在前期研究中，利用β-環糊精聚合物作為藥物載體，通過超分子化學作用制備得到了水溶性和抗氧化活性良好的CUR/CDP[12]。本研究在前期研究的基礎上，主要考察CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷的保護作用，為其在保護酒精性肝損傷中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素超分子包合物 實驗室自制；姜黃素（Curcumin, CUR）標準品 美國Sigma公司；細胞裂解液RAPI、BCA蛋白測試盒和活性氧檢測試劑盒

碧云天生物技術有限公司；總超氧化物歧化酶測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、丙二醛測試盒、乳酸脫氫酶測試盒、天門冬氨酸氨基轉移酶測試盒和丙氨酸氨基轉移酶測試盒 南京凱基生物科技發展有限公司；胎牛血清、PBS、DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶溶液和雙抗溶液 美國Gibco公司；異丙醇、二甲基亞砜（DMSO）溶液 分析純，天津市大茂化學試劑廠；MTT試劑 分析純，上海源葉生物科技有限公司；LO2細胞 購于美國ATCC公司;β-環糊精 化學純，山東新大精細化工有限公司；其他化學試劑 均購于國藥集團化學試劑有限公司。

AUW120電子天平 日本島津公司；XRDKQ-500DB型數控超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；Varioskan Flash多功能酶標儀、移液槍 美國Thermo Fisher Scientific公司；DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科學有限公司；HL-6數顯恒溫水浴鍋

常州奧華儀器有限公司；Eppendorf 5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；FD8508真空冷凍干燥機

韓國ilshin公司；EYELA旋轉蒸發儀 日本EYELA公司；CKX41倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CUR/CDP的制備 CUR/CDP的具體制備方法參考陳建平等[13?14]方法進行。稱取15.76 g NaOH和20 gβ-環糊精，加32 mL H2O攪拌溶解，在30 ℃下緩慢加入環氧氯丙烷（EPC）9.64 mL，攪拌24 h后，冷卻至室溫。經超聲功率為80 W超聲5 min后，將溶液倒入透析袋屮透析至中性，抽濾去除不溶物，經0.45 μm纖維素膜過濾后旋蒸至粘稠狀，加入無水乙醇析出白色固體，經過濾、真空干燥即得β-環糊精聚合物。將姜黃素和β-環糊精聚合物按質量比1:4研磨混勻，加50 mL蒸餾水，在120 W下超聲5 min后，經磁力攪拌2 d，將溶液抽濾、旋蒸和真空干燥，即得水溶性姜黃素超分子包合物。

1.2.2 細胞培養 LO2細胞經復蘇后轉移至DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清和1%雙抗溶液）中，并將細胞培養瓶置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，待細胞密度長至80%左右時進行傳代，取對數生長期的細胞用于后續的實驗。

1.2.3 乙醇誘導LO2細胞損傷模型的建立 在實驗組與對照組加入8×104個細胞/mL的細胞懸液于96孔板中，而空白組中用DMEM高糖培養基代替細胞懸液，每孔100 μL。培養24 h后去除培養基，然后，實驗組中加入200 μL不同濃度（100~800 mmol/L）的乙醇溶液，而空白組和對照組中均分別加入200 μL DMEM高糖培養基。培養6 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT孵育4 h。然后，用注射器抽掉上清液，加入150 μL DMSO反應10 min。采用酶標儀測量各個孔在570 nm處的吸光值。根據公式（1）計算細胞存活率。

式中：A0表示空白組的OD值；A1表示對照組的OD值；A2表示實驗組的OD值。

1.2.4 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷的影響

在實驗組與陰性對照組加入8×104個細胞/mL的細胞懸液于96孔板中，而空白組中用DMEM高糖培養基代替細胞懸液，每孔100 μL。培養24 h后，實驗組中加入100 μL 不同濃度（0~80 μg/mL）的CUR/CDP，而空白組和陰性對照組中均分別加入100 μL DMEM高糖培養基。培養12 h后，采用移液器抽掉培養基。然后，實驗組中加入200 μL 600 mmol/L乙醇，而空白組和陰性對照組中均分別加入200 μL DMEM高糖培養基。培養6 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液孵育4 h。然后，采用注射器抽掉上清液，加入150 μL DMSO溶液反應10 min。采用酶標儀測量各個孔在570 nm處的吸光值。根據式（1）計算細胞存活率。

1.2.5 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷后ALT、AST、LDH、SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響 將LO2細胞懸液以2×105個細胞/mL的密度接種于無菌培養皿中，每個培養皿添加5 mL的DMEM高糖培養基，培養24 h后，分別加入不同濃度的CUR/CDP培養12 h后去除培養液，加入5 mL 600 mmol/L乙醇培養6 h后，將培養液收集于離心管中。根據ALT、AST和LDH試劑盒的操作方法檢測細胞培養液中ALT、AST和LDH活力。并根據SOD、GSHPX和MDA試劑盒的操作方法檢測細胞內的SOD、GSH-PX活力和MDA含量。

1.2.6 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷后ROS含量的影響 將LO2細胞以8×104個細胞/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24 h后，分別加入100 μL不同濃度的CUR/CDP培養12 h后用移液器去除培養液，加入200 μL 600 mmol/L乙醇培養6 h后，加入300 μL DCFH-DA孵育30 min。用PBS洗滌3次，采用酶標儀測量各個孔在激發波長為488 nm、發射波長為525 nm條件下的熒光強度。

1.3 數據處理

每次實驗重復3次，實驗數據均以平均值±標準差（x ˉ±s）表示。實驗結果采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，采用T檢驗對兩組之間的數據進行比較，P<0.05為差異具有顯著意義，P<0.01為差異具有極限顯著意義。

2 結果與分析

2.1 LO2細胞損傷模型的建立

由圖1可知，細胞經不同濃度的乙醇處理6 h后，細胞存活率隨著乙醇濃度的升高呈下降趨勢。當乙醇濃度為600 mmol/L時，細胞存活率從對照組的100%±6.57%下降至54.79%±4.41%（P<0.05），為中度損傷。故選擇此濃度進行后續實驗。

圖 1 不同濃度的乙醇對LO2細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different ethanol concentrations on the cell viability of LO2 cells

2.2 CUR/CDP對乙醇損傷LO2細胞存活率的影響

由圖2可知，當80 μg/mL CUR/CDP對細胞進行單獨處理后，細胞存活率從陰性對照組的100%下降到89.61%±1.87%，表現出輕微的細胞毒性。然而，相比600 mmol/L乙醇單獨處理的模型對照組，當細胞經10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，可以顯著提高細胞經乙醇處理后的細胞存活率（P<0.05），且呈現出對包合物濃度的依賴性。當CUR/CDP濃度達到80 μg/mL時，細胞存活率從54.75%±8.97%（模型對照組）提高到85.27%±2.64%，表明CUR/CDP對乙醇誘導細胞損傷具有保護作用，這可能是由于CUR/CDP的抗氧化活性降低了乙醇誘導細胞內ROS的產生，從而起到保護肝細胞損傷的作用。

圖 2 CUR/CDP對乙醇損傷LO2細胞存活率的影響Fig.2 Effects of CUR/CDP on the cell viability of LO2 cells injured by ethanol

2.3 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷后ALT、AST和LDH活力的影響

由表1可知，與陰性對照組相比，模型對照組中的ALT、AST和LDH活力極顯著上升（P<0.01）；相比模型對照組，細胞經10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，能降低ALT、AST和LDH活力，且呈現出濃度依賴性。當CUR/CDP的濃度達到80 μg/mL時，ALT、AST和LDH活力從模型組的（26.47±0.90）、（41.02±4.41）和（63.77±4.95）U/L降至（16.17±0.42）、（22.62±0.79）和（32.25±1.69）U/L。這可能是由于CUR/CDP的抗氧化活性避免了細胞因ROS含量的升高導致其細胞膜破損引發細胞內ALT、AST和LDH的釋放，使得細胞外ALT、AST和LDH活力相應降低。

2.4 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷后SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響

由表2可知，與陰性對照組相比，模型對照組中的SOD和GSH-PX活力極顯著降低，而MDA的含量極顯著上升（P<0.01）；相比模型對照組，細胞經10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，能升高SOD、GSH-PX活力和降低MDA的含量，并且表現出濃度依賴性。當CUR/CDP濃度達到80 μg/mL時，SOD、GSH-PX活力從模型組的（8.45±1.11）、（21.82±1.34）U/mg prot增至（16.47±1.27）、（36.70±0.56）U/mg prot，而MDA含量從模型組的（1.19±0.15）nmol/mg prot降低到（0.72±0.05）nmol/mg prot。這可能是由于CUR/CDP處理細胞后，其抗氧化作用提高了細胞內抗氧化酶SOD、GSH-PX的活力，從而清除了細胞內乙醇誘導產生的ROS，進而降低了MDA的含量。

2.5 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷后活性氧（ROS）含量的影響

由圖3可知，與陰性對照組相比，模型對照組中ROS含量極顯著上升（P<0.01）；而經CUR/CDP處理后，能明顯降低細胞內ROS含量，當CUR/CDP濃度達到80 μg/mL時，ROS含量從模型對照組198.02%±11.76%降低到110.87%±10.22%。實驗結果表明，CUR/CDP是通過降低ROS含量來減輕乙醇誘導LO2細胞的損傷。這可能是由于細胞經CUR/CDP預處理后，其抗氧化作用能夠有效清除細胞內的自由基使得細胞內ROS的含量降低，達到保護細胞的目的。

表 1 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷后ALT、AST和LDH活力的影響Table 1 Effects of CUR/CDP on the activities of ALT, AST and LDH in the culture medium of LO2 cells damaged by ethanol

表 2 CUR/CDP對乙醇損傷LO2細胞中SOD活力、GSH-PX活力和MDA含量的影響Table 2 Effects of CUR/CDP on SOD activity, GSH-PX activity and MDA contents in LO2 cells damaged by ethanol

圖 3 CUR/CDP對乙醇誘導LO2細胞損傷后ROS含量的影響Fig.3 Effects of CUR/CDP on ROS content in LO2 cells damaged by ethanol

3 討論

盡管目前有文獻報道酒精性肝損傷的相關發病機制，但其具體的發病機理尚無定論。有研究認為，酒精代謝產物、氧化應激、炎癥介質等與酒精性肝損傷有關。長期或過量攝入酒精會使酒精在肝臟的代謝過程中抑制線粒體中乙醛的氧化反應，造成酒精代謝產物乙醛在肝臟中不斷地積累[15]。肝臟中積累的乙醛會破壞肝細胞的內膜結構、損傷線粒體、影響肝臟的微管系統、引起肝纖維化等，從而導致肝損傷[16]。而且，機體內過量的酒精會在肝臟中發生氧化反應導致機體產生大量的活性氧，同時也會造成谷胱甘肽等抗氧化物質含量顯著降低，從而導致線粒體結構遭到破壞，最終引起肝臟損傷[17]。

在正常情況下，ALT、AST和LDH主要存在于肝細胞中，當肝細胞受到損傷時，ALT、AST和LDH會被釋放到培養液中，使得細胞培養液中的ALT、AST和LDH含量顯著升高，故通過檢測培養液中ALT、AST和LDH的含量可反映出肝細胞的受損程度[3,18?19]。在本研究中，經過乙醇損傷后LO2細胞培養液中ALT、AST和LDH活力極顯著升高（P<0.01），這說明乙醇破壞了LO2細胞的細胞膜結構，對LO2細胞造成了一定程度的損傷。經10~80 μg/mL CUR/CDP預處理后，LO2細胞培養液中ALT、AST和LDH活力隨著CUR/CDP濃度的升高逐漸降低，這說明CUR/CDP對LO2細胞具有保護其細胞膜結構的能力。

MDA是細胞內脂質發生氧化反應后的主要產物，細胞內MDA的含量反映了細胞內脂質過氧化的程度[20]。GSH-PX是細胞內的一種過氧化物酶，能夠清除細胞內發生了氧化反應的脂質[21]。SOD是機體防御細胞發生氧化反應的首要防線，能夠快速地清除氧自由基，防止機體受到損傷[22?23]。當細胞受到損傷時，細胞內的GSH-PX和SOD可以通過清除細胞內被氧化的脂質以及氧自由基來維持細胞內的氧化還原穩態，從而達到保護細胞的作用。在本研究中，經乙醇損傷后，細胞內GSH-PX活力和SOD的活力出現極顯著降低（P<0.01），MDA的含量極顯著上升（P<0.01），這說明乙醇破壞了細胞內的氧化還原穩態，使得細胞受到損傷。當LO2細胞經CUR/CDP預處理后，細胞內GSH-PX活力和SOD活力明顯恢復，MDA含量明顯降低，表明CUR/CDP能夠改善乙醇對細胞造成的損傷。

乙醇在肝臟中會被細胞色素P450（CYP2E1）氧化，此過程會產生過量的活性氧（ROS），而ROS是細胞內氧化應激狀態發生的重要因素之一[24]。當肝臟受到過量乙醇刺激時，肝細胞內ROS的含量會顯著增加，從而導致肝損傷[25?27]。在本研究中發現，經10~80 μg/mL CUR/CDP處理乙醇誘導的細胞后，細胞內ROS含量隨著CUR/CDP濃度的增加呈降低趨勢，表明，CUR/CDP能夠抑制乙醇誘導細胞內的氧化應激狀態，從而達到保護細胞的目的。

4 結論

本文通過建立乙醇誘導肝細胞損傷模型和采用ALT、AST、LDH、SOD、GSH-PX、MDA和ROS試劑盒檢測CUR/CDP對乙醇誘導細胞損傷后其相關酶活性和MDA、ROS含量的影響。研究發現，CUR/CDP能夠降低ALT、AST、LDH、MDA和ROS的含量，同時也能恢復SOD和GSH-PX的活力，這表明CUR/CDP通過提高細胞內抗氧化酶的活力以及降低MDA和ROS含量來達到保護細胞的目的。綜上所述，姜黃素超分子包合物具有改善乙醇誘導LO2細胞損傷的能力，為其今后在肝損傷領域和預防肝癌等臨床的應用與開發提供了理論基礎和數據參考。