苯酚-硫酸法測定酒蒸多花黃精多糖含量的優化

王迎香，唐子惟，彭 騰，陳胡蘭，高天宇，何沛煜，張軍銀

（成都中醫藥大學藥學院，四川成都 611137）

黃精，傳統補益藥，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎功能。明代繆希雍撰寫的藥學著作《本草經疏》中曾記載：“雖非治療之所急，而為養性之上藥。故仙經累贊其能服餌駐顏，久而彌勝矣”。黃精因性平、無毒，在2002年被收錄在藥食同源目錄中，一直延續至今。經過現代藥理學研究證明，黃精多糖能夠抑制腫瘤，提高動物免疫調節作用，對糖尿病模型有顯著作用[1?5]。黃精水煎液提取物對體外皮膚紫外線實驗中表現出抗衰老作用[6]，提示在人體保健方面具有延緩衰老功效。此外，基于網絡藥理學[7]對黃精有效成分進行預測，黃精可用于抗疲勞。有研究對保健食品進行調查統計，發現中藥類保健品占據較大的市場份額。其中以增強免疫力功能的保健食品占額最多，黃精的添加使用頻率高達中藥類原料排名前20[8?9]。現已有黃精代泡茶、黃精粉等產品用于食品營養。黃精中主要活性成分為多糖類，多糖含量的測定是黃精質量標準研究的重要考察項目。因此，準確測量黃精的多糖含量對保健食品的應用開發具有深遠意義。

植物多糖為天然高分子化合物，因其復雜的分子結構而具有廣泛的活性作用[10?11]，添加于保健食品的多糖對腸道調節有積極影響[12?14]。測定多糖的方法涵括比色法、高效液相色譜法、氣相色譜法等，其中比色法因操作方便而被廣泛采用。有學者[15?16]探究比色法測定原理，比色法通常利用濃硫酸與多糖樣品混合進行短時間的水解反應，生成寡糖和單糖，再與顯色劑進行顯色反應，在紫外分光光度計下進行吸光度測定。此過程中，濃硫酸水解的完全、顯色劑的選擇等條件對多糖的測量都表現出影響。在測量黃精多糖時蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法使用頻率最高。

兩種方法原理相似，但反應條件不同，顯色劑不同，二者用于測量其他藥材多糖含量時存在差異[17]。蒽酮-硫酸法測定黃精多糖收錄于2020年藥典一部，但該方法穩定性需要控制好測定條件，如蒽酮結構不穩定需現用現配、注意避光等問題[18]。本課題組前期多次重復實驗發現顯色前配制蒽酮時間過早，對測定吸光度影響較大，管控配制時間過于繁瑣。有現代大量研究發現采用苯酚-硫酸法測定黃精多糖操作簡單、穩定性好[19?20]。苯酚-硫酸法測定多糖技術雖較為成熟，但在采用苯酚-硫酸法測定黃精多糖時存在所用苯酚濃度、硫酸用量、顯色時間等條件不統一的問題，如用過多的濃硫酸會糖碳化從而影響吸光度[21]。目前2020版中國藥典中測量黃精多糖并未規范此方法，為建立更合適的苯酚-硫酸測量黃精多糖的方法，本研究選取苯酚濃度、苯酚用量、硫酸用量、加熱時間、加熱溫度五個因素進行單因素考察。在此基礎上對苯酚-硫酸法的測定條件進行響應面優化，建立適宜酒蒸黃精多糖測量的最優顯色條件，旨在為未來中國藥典制定酒黃精質量標準提供有力研究基礎，為該藥材資源的合理開發及質量控制提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精藥材 采于四川省達州市大竹縣，經成都中醫藥大學生藥學教研室龍飛副教授鑒定為百合科多花黃精（Polygonatum cyrtonemaHua）的干燥根莖；D-葡萄糖對照品 四川維克奇生物有限公司；黃酒 紹興舜豐釀酒有限公司；98%濃硫酸 四川西隴科學有限公司；苯酚 成都市科隆化學品有限公司；蒽酮 成都市科隆化學品有限公司。

紫外分光光度計SPECORD 200 plus 德國耶拿分析儀器股份公司；手提式中藥粉碎機 溫嶺林大機械有限公司；電蒸鍋 廣東山姆斯電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒蒸黃精多糖溶液制備 參照2020年藥典一部方法。

1.2.1.1 酒蒸黃精制備 取凈黃精，照酒蒸法（通則0213）。每100 kg黃精，用黃酒20 kg拌勻，于300 W電蒸鍋上蒸制6 h，晾至室溫，切4 mm厚片，干燥。得到酒蒸黃精飲片，打粉，過5號篩，備用。

1.2.1.2 多糖溶液制備 精密稱定酒黃精細粉0.25 g，加80%乙醇150 mL，水浴加熱回流1 h，殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，棄去濾液。將殘渣和濾紙置于燒瓶中，加水150 mL，沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，合并濾液，放冷，轉移至250 mL容量瓶中，定容，備用。

1.2.2 蒽酮-硫酸法測定多糖

1.2.2.1 標準曲線繪制 配制好葡萄糖標準溶液與蒽酮-硫酸溶液后，參照2020年藥典一部中測量黃精多糖時標準曲線的制作方法繪制標準曲線。

1.2.2.2 樣品多糖含量測定 精密量取多糖溶液1.0 mL，同“1.2.2.3”項進行顯色。帶入標準曲線，計算樣品含量。

1.2.3 苯酚-硫酸法測定多糖 參照本課題組已有研究基礎[22]測量黃精多糖含量。

1.2.3.1 標準曲線繪制 取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL葡萄糖標準溶液于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至2 mL刻度線，搖勻，試管置于冰水浴中。試管中加入1 mL苯酚溶液，搖勻后盡快加入7 mL的濃硫酸溶液，搖勻。放冷后于40 ℃水浴中保溫30 min，取出放入冰水水浴5 min，取出后恢復至室溫。以相應顯色試劑作為空白組，于490 nm波長下測定吸光度，計算回歸方程。

1.2.3.2 樣品多糖含量測定 精密量取多糖溶液1.0 mL，同“1.2.3.3”項進行顯色。帶入標準曲線，計算樣品含量。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 精密度考察試驗 分別移取“1.2.1”項下黃精多糖溶液1.0 mL于具塞試管中，按照蒽酮-硫酸法進行顯色，以蒸餾水為參比，在紫外分光光度計特定波長下連續測定吸光度5次，計算RSD值，考察精密度。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.2 重現性考察試驗 分別移取5份“1.2.1”項下黃精多糖溶液1.0 mL于具塞試管中，按照蒽酮-硫酸法進行顯色，以蒸餾水為參比，在紫外分光光度計特定波長下測定吸光度，計算RSD值，考察重現性。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.3 穩定性考察試驗 分別移取“1.2.1”項下黃精多糖溶液1.0 mL于具塞試管中，按照蒽酮-硫酸法進行顯色，以蒸餾水為參比，在紫外分光光度計特定波長下進行時間-吸光度曲線的掃描，考察穩定性。苯酚-硫酸法同上。

1.2.4.4 加樣回收率考察試驗 精密量取5份已測含量的黃精多糖溶液，分別加入已知含量的葡萄糖標準溶液，按照蒽酮-硫酸法進行顯色，以相應空白組為參比，在紫外分光光度計特定波長下測定吸光度，計算回收率。苯酚-硫酸法同上。

1.2.5 苯酚-硫酸法工藝優化 選擇苯酚-硫酸法進行深入工藝優化實驗。

1.2.5.1 單因素實驗 根據已有研究[23?25]選定五個單因素條件進行試驗。按照“1.2.3”項苯酚-硫酸法顯色條件，進行單因素對吸光度的影響考察。在固定苯酚用量1.0 mL、苯酚濃度5%、硫酸用量7 mL、加熱溫度50 ℃、加熱時間20 min的條件下，每個因素設置5個水平：苯酚用量（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）、加熱時間（10、15、20、25、30 min）、加熱溫度（40、50、60、70、80 ℃）、苯酚濃度（3%、4%、5%、6%、7%）、硫酸用量（5、6、7、8、9 mL）。

1.2.5.2 響應面試驗設計 根據單因素的實驗結果，選取苯酚用量（A）、苯酚濃度（B）、硫酸用量（C）3個因素為自變量，結合Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken分析，設計響應面試驗對苯酚-硫酸法測定黃精多糖含量條件進行優化，設計因素見表1。

表 1 Box-Behnken試驗設計Table 1 Box-Behnken experimental designs

1.3 數據處理

每組試驗重復3次，試驗結果以均值±標準差表示。單因素實驗結果用SPSS23.0進行顯著性篩選，響應面試驗結果用Design-Expert 8.0.6進行數據分析，用Origin 8.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 最大波長的確定

兩種方法顯色后，以相應試劑為空白，于分光光度計上進行波長掃描，見圖1~圖2。在400~800 nm的可見光范圍內，苯酚-硫酸法最大吸收波長為489 nm，但多次掃描過程中波峰出現平峰，集中在488~491 nm區間，為規范化操作故參照文獻中苯酚-硫酸測定方法取490 nm進行試驗。蒽酮-硫酸法最大吸收波長為580 nm，參照中國藥典中蒽酮-硫酸測定方法取582 nm進行試驗。

圖 1 蒽酮-硫酸法波長掃描Fig.1 Wavelength scanning of anthrone sulfuric acid method

圖 2 苯酚-硫酸法波長掃描Fig.2 Wavelength scanning of anthrone sulfuric acid method

2.2 線性關系考察

2.2.1 蒽酮-硫酸法 按“1.2.2.3”項進行顯色，以葡萄糖濃度為橫坐標、以吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線如圖3所示。擬合得到線性回歸方程y=0.0269x+0.0739，R2=0.9991。表明該線性方程在葡萄糖濃度3.3~26.4 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

圖 3 蒽酮-硫酸法標準曲線Fig.3 Standard curve of anthrone sulfuric acid method

2.2.2 苯酚-硫酸法 按“1.3.3.3”項進行顯色，以葡萄糖濃度為橫坐標、以吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線如圖4所示。擬合得到線性回歸方程y=0.0689x?0.0225，R2=0.9992。表明該線性方程在葡萄糖濃度3.5~14 μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

圖 4 苯酚-硫酸法標準曲線Fig.4 Standard curve of phenol sulfuric acid method

2.3 精密度試驗結果

分別采用兩種方法對黃精多糖進行顯色反應，連續測量吸光度值5次，測得吸光度分析結果見表2。

表2 顯示，連續測定5次吸光度后，苯酚-硫酸法的RSD=0.01%，蒽酮-硫酸法的RSD=0.20%，表明苯酚-硫酸法相比蒽酮-硫酸法精密度高。

2.4 重現性測試結果

分別采用兩種方法對5份黃精多糖進行顯色反應，測定吸光度值，測得吸光度分析結果見表3。

表3 顯示，對5份黃精多糖溶液進行吸光度測定后，苯酚-硫酸法的RSD=1.73%，蒽酮-硫酸法的RSD=1.84%，表明苯酚-硫酸法相比蒽酮-硫酸法重現性好。

2.5 穩定性測試結果

采用兩種方法分別對黃精多糖溶液進行顯色，在紫外分光光度計上進行時間掃描，掃描時間為120 min，掃描結果如圖5。

圖 5 時間掃描曲線Fig.5 Time scan curve

圖5 時間掃描顯示，顯色后吸光度在120 min內波動較小，說明兩種方法顯色的黃精多糖吸收曲線受環境溫度和時間的影響變化不大，在120 min內保持穩定。二者相比之下，苯酚-硫酸法波動較蒽酮-硫酸法更加微小，穩定性好。

2.6 加樣回收率測試結果

精密稱取已知多糖含量的黃精粉末，分為兩組平行實驗。加入精密稱定的葡萄糖對照品，設置五水平，平行重復三次。分別采用兩種顯色方法進行吸光度測量，計算平均回收率，測試結果如表4。

表4 顯示，蒽酮-硫酸法平均回收率低于苯酚-硫酸法。蒽酮-硫酸法的RSD=1.38%，遠高于苯酚-硫酸法，表明苯酚-硫酸法所測結果相對更加穩定，苯酚-硫酸法用于多糖顯色更加可行。

綜合方法學考察結果，蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法各項RSD都在規定范圍內，兩種方法可靠、可行。二者RSD結果對比來看，苯酚-硫酸法每一項都低于蒽酮-硫酸法，表明用苯酚-硫酸法測定多糖含量更精確度高、重現性好、穩定性好、加樣回收率高。綜合實際操作性，苯酚-硫酸法加熱溫度和時間都低于蒽酮-硫酸法，處理樣品時更加方便快捷。因此，下一步將進行苯酚-硫酸法顯色條件優化。

表 2 精密度測試結果Table 2 Precision test results

表 3 重現性測試結果Table 3 Reproducibility test results

表 4 回收率試驗結果Table 4 Recovery test results

2.7 多糖含量測定

用兩種方法對樣品進行含量測定，以相應的顯色試劑為空白組，帶入線性方程計算結果，蒽酮-硫酸法測得含量為8.01%，苯酚-硫酸法測得含量為7.89%。

2.8 單因素實驗結果

2.8.1 苯酚用量對吸光度影響 不同苯酚用量對吸光度的影響見圖6。加入5%濃度苯酚，用量從0.5 mL增加到1.5 mL時，溶液吸光度迅速升高，且達到極值。繼續增大苯酚用量，達到1.5 mL后吸光度趨于平緩，后有下降趨勢。這與參考文獻[21]得到的結果一致，推測在低用量時吸光度與反應底物呈正相關，苯酚用量達到飽和后吸光度不再增加。后呈現減小的趨勢，推測是多糖與濃硫酸反應的同時過多的苯酚與濃硫酸產生磺基化反應[26]，導致多糖未完全脫水形成糖醛衍生物與苯酚結合顯色。雖然苯酚與濃硫酸反應生成物含有顯色團，但相比于糖與苯酚的結合顯色，整體表現為吸光度減少的趨勢。故苯酚用量選1.5 mL適宜。

圖 6 苯酚用量對吸光度的影響Fig.6 Effect of phenol dosage on absorbance

2.8.2 苯酚濃度對吸光度影響 不同苯酚濃度對吸光度的影響見圖7。加入1 mL苯酚，吸光度與苯酚濃度整體成正比關系。在濃度為5%時吸光度達到增長率最大，加大苯酚濃度，增長趨于平緩且有下降趨勢。推測同“2.8.1”項下，苯酚濃度達到一定程度后顯色反應飽和，過多的苯酚影響了多糖與濃硫酸的反應導致吸光度下降。故苯酚濃度選擇5%合適。

2.8.3 硫酸用量對吸光度影響 不同硫酸用量對吸光度的影響見圖8。在低用量范圍內，吸光度與硫酸用量整體呈現正趨勢相關。在7 mL時吸光度達到最大值，后增長緩慢且有下降趨勢。推測是因為7 mL時反應達到飽和，再增大用量，多余的濃硫酸使糖碳化，影響顯色效果[21]。故硫酸用量為7 mL合適。

圖 7 苯酚濃度對吸光度的影響Fig.7 Effect of phenol concentration on absorbance

圖 8 硫酸用量對吸光度的影響Fig.8 Effect of sulfuric acid dosage on absorbance

2.8.4 加熱溫度、加熱時間對吸光度影響 不同加熱溫度、加熱時間對吸光度影響見圖9~圖10。考察結果利用SPSS軟件進行單因素分析，發現這二者因素的數據并不具有顯著差異性（P?0.05），提示加熱溫度、加熱時間對吸光度的影響甚微。推測是因為苯酚-濃硫酸顯色反應原理是樣品中的多糖在濃硫酸作用下脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚進行縮合反應，此顯色反應本身為放熱反應，放出大量熱量，外界溫度對反應影響較小[17]。故二者對吸光度影響并不明顯。在進行苯酚-硫酸法測量多糖工藝優化時可忽略加熱溫度、加熱時間二者影響。

圖 9 加熱溫度對吸光度的影響Fig.9 Effect of heating temperature on absorbance

圖 10 加熱時間對吸光度的影響Fig.10 Effect of heating time on absorbance

2.9 響應面優化試驗結果與分析

2.9.1 響應面優化試驗結果 根據“2.8”項下單因素的實驗結果，選取苯酚用量（A）、苯酚濃度（B）、硫酸用量（C）3個因素為自變量進行條件優化。結合Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken分析，設計了17個試驗點的響應面試驗方案，試驗結果如表5。

表 5 響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of response surface test

2.9.2 模型擬合與方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對“2.9.1”項下試驗數據進行擬合，并建立二次多元回歸方程：

回歸方程分析結果如表6。模型的F=66.69，P<0.0001，表明試驗選擇的二次模型具有顯著性，且失擬項P=0.1153，不顯著，模型與實際非正常誤差所占比例較小，說明模型擬合良好，能夠較準確反映吸光度與苯酚用量、苯酚濃度、硫酸用量之間的關系。回歸方程的確定系數R2=0.9885，表明此模型能夠反映97.37%的吸光度變化；校正確定系數R2adj=0.9737，二者都大于0.9，接近于1，表明此模型與實際的實驗結果擬合效果好，作吸光度的預測可靠。變異系數C.V.=4.16<5，變異系數越小，表明偏離程度越小，該模型精確度高。分析各項P值表現的顯著性，因素C、C2的P值呈現高度顯著性（P<0.001），對實驗結果影響高度顯著（P<0.001）；因素B、A2、B2也有極顯著影響（P<0.01）；因素A、AB、BC也有顯著影響（P<0.05）。通過比較F值大小可知，在選定水平范圍內各因素對吸光度的影響大小為：硫酸用量>苯酚濃度>苯酚用量。

表 6 方差分析和顯著性差異結果Table 6 Analysis of variance and significant difference results

2.9.3 等高線圖及響應面圖分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制等高線圖及響應面圖，結果見圖11。通過等高線圖和響應面圖能夠直觀反映各因素之間的交互影響。等高線為平面圖，愈趨近于橢圓形則表明交互作用對響應值的影響顯著，反之，圓形則不顯著。響應面為立體圖，坡度愈陡，交互作用影響顯著，反之，平緩則不顯著。結合各因素的等高線圖與響應面圖可見，因素B與C，即苯酚濃度、硫酸用量二者交互作用最明顯，其次是因素A與B，即苯酚用量與苯酚濃度。

圖 11 各因素交互作用影響的等高線圖及響應面圖Fig.11 Contour map and response surface map of interaction of various factors

根據上述結果，結合模擬方程進行優化，得到的預測最優條件為：苯酚用量1.54 mL、苯酚濃度4.42%、硫酸用量6.49 mL，預測吸光度為0.7455，結合實際操作的可行性，調整實際參數為苯酚用量1.5 mL、苯酚濃度4.5%、硫酸用量6.5 mL。

2.9.4 工藝驗證 按“2.9.3”項下確定的實際可行的最優工藝進行驗證實驗，當測量條件苯酚用量1.5 mL、苯酚濃度4.5%、硫酸用量6.5 mL時測定吸光度為0.7327，接近預測值，該最優工藝穩定可靠。酒黃精樣品多糖平均含量8.50%，RSD=0.87%。

3 結論與討論

本實驗選取了五因素五水平進行單因素實驗，其中苯酚用量、苯酚濃度、硫酸用量表現出顯著差異性（P<0.05），而加熱溫度、加熱時間的實驗結果不具有統計學意義，因此選取苯酚用量、苯酚濃度、硫酸用量進行響應面分析實驗。各因素對吸光度的影響大小為：硫酸用量>苯酚濃度>苯酚用量。優化后的最佳顯色條件是苯酚用量1.5 mL、苯酚濃度4.5%、硫酸用量6.5 mL。對酒黃精多糖進行測定，平均含量為8.50%，相對標準偏差為0.87%。

本實驗選取了多糖含量測定常用的兩種方法進行測定。在線性關系、精確度、重現性、穩定性、加樣回收率的考察結果中，蒽酮-硫酸法及苯酚-硫酸法二者均能可靠、有效測定酒黃精中的多糖含量。但蒽酮-硫酸法需提前配制，保存不便易變質，在穩定性試驗中明顯低于苯酚-硫酸法。此外，兩種方法對同一樣品測量結果存在差異，苯酚-硫酸法低于蒽酮硫酸法，與課題組前期研究[22]結果一致。孫曉燕等[27]研究發現，苯酚-硫酸法受酒蒸黃精中所含蛋白質影響較小，測量更加靈敏，酒黃精多糖含量更加準確。苯酚-硫酸法所要求的反應條件較為簡單，操作簡單快捷。但是在苯酚-硫酸法的操作過程中發現苯酚長期暴露在空氣中易氧化，加入試管后濃硫酸應盡快加入，以免造成人為誤差。蒽酮-硫酸法易受蛋白質等物質影響，按照藥典中黃精多糖的提取方法進行提取，發現蛋白質未完全除凈，對蒽酮法測量多糖存在較大干擾。現常用Sevage法、酶法、三氯乙酸法進行黃精多糖的純化[28?30]，故認為藥典中所收錄的黃精多糖溶液提取方法還需進一步考慮蛋白質對測量結果的影響，更新優化提取方法。

本實驗建立了適宜酒蒸黃精多糖的最優苯酚-硫酸測量工藝，填補了目前酒黃精研究領域中的空缺，為后期全面深入研究黃精九蒸九曬炮制品、生品中多糖含量的測量提供了科學依據；為未來中國藥典制定酒黃精質量標準提供了有力的研究基礎；為黃精藥食同源產品的開發提供了參考價值。