通過型固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞肉中23種磺胺類藥物殘留

楊 坤，劉桂瓊，管春成，陳光靜

（1.黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州凱里 556012；2.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽 550005）

磺胺類藥物（sulfonamides，sAs）是人工合成的具有對氨基苯磺酰胺結構的抗生素[1?3]，能夠抑制細菌的生長繁殖，具有較強的抗菌作用，因其優異的抗菌譜廣、價廉、使用方便而廣泛用于畜牧生產。但磺胺類藥物的不合理使用，可通過肉類食品在人體內蓄積而給人體造成各種潛在危害[4?6]，且磺胺類藥物存在嚴重副作用和潛在的致癌性，其耐藥性問題也日益嚴重。因此，我國以及歐盟、美國等大多數國家對食品中磺胺類藥物的最高殘留量均有明確規定，如我國規定所有食用動物的肌肉、脂肪、肝、腎食品中磺胺類藥物的最大殘留量為0.1 mg/kg[7]。

磺胺類藥物殘留問題越來越受社會的關注，其檢測方法主要有酶聯免疫法[8]、液相色譜法[9?10]、液相色譜-串聯質譜法[11?17]等。酶聯免疫法屬于半定量篩查法，容易出現假陽性現象。液相色譜法靈敏度低，抗干擾能力弱，定性效果差。液相色譜-串聯質譜法具有液相色譜的分離能力和質譜的高靈敏度和準確度，但存在分析時間較長。超高效液相-串聯質譜法可在較短時間內分析目標化合物，正逐漸成為獸藥殘留分析的有效手段。

磺胺類藥物殘留的前處理主要有液液萃取[18?19]、固相萃取[20?23]、基質固相分散萃取[24?25]等方法，這些方法存在有機溶劑消耗量較大，操作復雜，檢測成本高等問題。PRiME HLB采用通過型的新型固相萃取柱，無需活化與平衡，只需上樣、淋洗和洗脫3個步驟即可完成樣品凈化過程，可將凈化速度提高40%[26]。目前國內外對PRiME HLB前處理的研究報道，主要為孫曉冬等[27]測定了液態乳中14種真菌毒素；方靈等[28]測定了牛奶中38種抗生素；郝杰等[29]僅研究14種磺胺類藥物殘留等。而通過型固相萃取凈化技術，應用于檢測雞肉中多種磺胺類藥物殘留的研究尚未報道。本研究采用PRiME HLB前處理方法，結合超高效液相色譜-串聯質譜法，建立測定雞肉中23種磺胺類藥物的測定方法。該方法簡便快速，易于操作，可為雞肉中多種磺胺類藥物殘留提供快速檢測方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇和乙腈 色譜級，德國Merck公司；甲酸色譜純，天津科密歐化學試劑；固相萃取小柱：Oasis PRiME HLB（60 mg，3 mL） 美國Waters公司；試驗用水為超純水；16批雞肉樣品 購于農貿市場；23種磺胺標準品（磺胺脒、磺胺醋酰、磺胺索嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧芐氨嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噁唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲基異噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺苯甲酰、磺胺苯吡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺硝苯） 純度均≥98%，德國Dr. Ehrenstorfer公司。

Agilent 1290 Infinity II型液相色譜儀 配二元高壓泵、自動進樣器和柱溫箱，美國Agilent公司；AB SCIEX API 4000+質譜聯用系統 配電噴霧離子源（ESI）及Analyst1.6.3數據處理軟件，美國AB SCIEX公司；Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、手動固相萃取裝置 美國Waters公司；Milli-Q純水機 美國Millipore公司；MS205DU電子天平 瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器公司；3-18k型高速冷凍離心機德國Sigma公司；E.T平行氮吹濃縮儀 北京萊伯泰科儀器公司；KQ-700DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理方法 稱取2.5 g（精確至0.01 g）雞肉樣品至50 mL聚丙烯離心管中，加入80%乙腈溶液（含0.2%甲酸）10 mL，渦旋振蕩10 min，8000 r/min冷凍離心10 min，轉移上清液于20 mL容量瓶中，重復提取一次，合并上清液，用提取液定容至刻度，待凈化。

取Oasis PRiME HLB固相萃取柱，無需活化與平衡，用移液管吸取5.0 mL提取液上固相萃取柱，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，再用2 mL 80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）沖洗，收集并合并流出液，40 ℃氮吹干，用10%的甲醇溶液（含0.1%甲酸）溶解并定容至1.0 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液上機分析。

1.2.2 標準溶液的配制 稱取10 mg（精確至0.1 mg）各標準物質，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度均為1.00 mg/mL的單標儲備液；吸取各單標儲備液1.0 mL至同一100 mL容量瓶中，以甲醇定容并混勻，配制成質量濃度為10 mg/L的混合標準工作溶液，于?18 ℃下密閉保存。

1.2.3 基質匹配標準溶液配制 按1.2.3操作獲得空白樣品凈化溶液。分別移取6份空白樣品凈化溶液1.0 mL于10 mL離心管中，分別加入質量濃度為20 ng/mL混合標準溶液10、20、50、100、200、1000 μL，氮吹至近干，用10%（體積分數，下同）的甲醇水溶液（含0.1%甲酸）溶解并定容至1.00 mL，配制成質量濃度分別為0.20、0.40、1.00、2.00、4.00、20.00 ng/mL的基質匹配標準溶液系列（該溶液現配現用），經0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液用于上機分析。

1.2.4 色譜條件 Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；進樣體積5 μL；流速0.25 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0~1.00 min，10%B；1.00~3.00 min，10%~20% B；3.00~7.00 min，20%~25% B；7.00~7.50 min，25%~60% B；7.50~9.00 min，60%~90% B；9.00~9.10 min，90%~10% B；9.10~12.00 min，10% B。

1.2.5 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）：正離子電離模式；去溶劑溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：172 kPa；碰撞氣壓力：41 kPa；離子氣1壓力：414 kPa；離子氣2壓力：379 kPa；噴霧電壓：5500 V；掃描方式：依賴保留時間的多反應監測（scheduled MRM），其他質譜參數條件見表1。

1.3 數據處理

方法重復性及回收率試驗均做6次重復試驗，采用Excel2016進行數據整理、分析，儀器數據采集軟件為Analyst1.6.3，數據分析軟件為MultiQuant2.1。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 提取溶劑的優化 磺胺類藥物分析常用的提取溶劑為乙酸乙酯[19]、乙腈[4,25,28]、乙腈水溶液[17,26]等。乙腈為提取液為中等極性溶劑與磺胺類藥物的極性接近，能使蛋白質變性沉淀且相對于乙酸乙酯不易提取出磷酯類等雜質，因此，選擇乙腈作為提取溶劑，并分別考察90%乙腈水溶液、80%乙腈水溶液、70%乙腈水溶液和60%乙腈水溶液4種提取溶液對目標化合物提取效果，結果見圖1。結果表明，80%乙腈水溶液作為提取液時23種磺胺類藥物的回收率較高，分析原因是60%乙腈水溶液和70%乙腈水溶液提取后的提取液較混濁，基質效應大，90%乙腈水溶液提取液雖較澄清，但90%乙腈水溶液過固相萃取柱時由于乙腈比例過高導致蛋白質快速凝結成團，從而阻止提取液進入萃取柱內部發生作用，這印證龔蘭[30]等在雞肉樣品中用80%乙腈水溶液提取6種磺胺類藥物回收率高。

由于磺胺類藥物化合物的分子結構中含有氨基和磺酰胺基，具有酸堿兩性，在提取液中加入一定比例的酸或堿提取可顯著提高回收率。考察了80%乙腈水、80%乙腈水（含0.2%甲酸）和80%乙腈水（含0.2%氨水）3種提取溶液對回收率的影響，結果見圖1。結果表明，酸性提取劑可獲得更優的回收率。因此，最終確定提取溶劑為80%乙腈水（含0.2%甲酸）。

圖 1 不同提取劑對磺胺藥物的平均回收率比較Fig.1 Comparison of average recovery rates of sulfonamides by different extracters

2.1.2 凈化條件的優化 本實驗采用PRiME HLB固相萃取柱對樣品進行凈化，因此，需要考察Oasis PRiME HLB（200 mg，6 mL）的柱容量，比較了不同上樣體積的樣品凈化程度。結果表明，上樣液中體積≤5 mL時，基質效應小，凈化效果明顯，而上樣體積為5~10 mL時，基質效應逐漸增加，說明上樣體積為5 mL時該柱對雜質的吸附能力接近飽和，過多的上樣體積會造成部分雜質無法吸附，隨目標化合物共流出，導致凈化效果不理想。因此，本實驗確定上樣體積為5 mL。

表 1 23種磺胺類藥物的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters of 23 sulfonamides

2.2 儀器條件的優化

2.2.1 色譜條件的優化 實驗考察了Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）對23種磺胺類藥物的分離效果。發現Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離效果好且有較高的靈敏度，質譜圖見圖2。因此，選擇Waters Acquity UPLC CSH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作為分離柱。

進一步對流動相的種類進行考察，當0.1%甲酸溶液作為水相選擇乙腈作為有機相時，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺間甲氧嘧啶3種同分異構體分離效果較差，把乙腈更換為甲醇為有機相時，上述3種待測物的分離的較好，結果見圖3，因此選擇甲醇作為有機相。選擇甲酸銨和乙酸銨作為水相時，磺胺硝苯和磺胺喹沙啉離子響應特別低，在水溶液中加入少量甲酸溶液作為流動相時能改善磺胺硝苯和磺胺喹沙啉的響應。因此，選擇0.1%甲酸溶液和甲醇作為流動相。

圖 2 混合標準溶液的質譜圖Fig.2 Mass spectrogram of mixed standard solution

圖 3 3種磺胺的同分異構體色譜圖Fig.3 Chromatograms of three sulfonamides

2.2.2 質譜條件優化 以流動注射方式在離子源正離子模式下對23種磺胺藥物進行母離子（Q1）全掃描，確定目標化合物的母離子，再對母離子進行二級質譜掃描（MS2），對去蔟電壓、碰撞能量等參數進行優化，每個化合物選擇2對響應值高的特征離子對作為定量及定性離子對，優化后的質譜具體參數見表1。在優化后的色譜條件和質譜參數下，23種磺胺藥物化合物的質譜圖見圖3，從圖可知，23種磺胺類藥物具有較好的分離度和靈敏度。

2.3 方法學考察

2.3.1 基質效應評估 按“1.2.1”方法進行前處理，“1.2.2”方法配制雞肉基質匹配標準溶液及純溶劑標準溶液并作校準曲線，按基質匹配標準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率比值大小顯示基質效應，斜率比越接近1，則基質效應越小[31?32]，結果見圖4。從圖可知，只有磺胺脒和磺胺硝苯基質效應抑制較大。因此，選擇用空白基質匹配標準溶液曲線來校正基質效應對其定量的影響。

圖 4 23種磺胺化合物在雞肉中的基質效應圖Fig.4 Matrix effect diagram of 23 sulfonamides in chicken

2.3.2 標準曲線、檢出限和定量限 在優化的提取凈化和UPLC-MS/MS分析條件下，23種化合物在雞肉空白樣品基質匹配標準溶液中的濃度與對應的峰面積呈良好的線性關系，相關系數為0.9996~0.9999，以定量離子3倍信噪比（S/N=3）得到檢出限（LOD），以定量離子10倍信噪比（S/N=10）得到定量限（LOQ），雞肉樣品的標準曲線和相關系數見表2。

2.3.3 實際樣品的檢測和加標回收率 采用本方法對農貿市場16批次雞肉進行檢測，均未檢出目標化合物。在雞肉空白樣品基質中各添加質量濃度為1.0、2.0、5.0 μg/kg三水平的23種磺胺類藥物的混合標準溶液測定回收率，每個添加水平重復測定6次，結果見表3。結果顯示，3個添加水平下雞肉樣品中23種磺胺獸藥的平均回收率為66.12%~99.83%，相對標準偏差為0.72%~10.36%。結果表明，該方法回收率較好，適用于雞肉中23種磺胺類藥物殘留檢測的方法要求。

表 2 23種磺胺類獸藥在雞肉樣品中標準曲線、相關系數、檢出限及定量限Table 2 Standard curve, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 23 sulfonamides in chicken samples

表 3 實際空白樣品中23種磺胺類藥物的加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Spiked recoveries rate and relative standard deviations of 23 sulfonamide drugs in real blank samples (n=6)

3 結論

本研究應用PRiME HLB前處理凈化技術，以超高效液相色譜-四級桿質譜聯用法建立了雞肉中23種磺胺類藥物殘留的檢測方法，通過對提取溶劑和凈化條件的優化，樣品經80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸）提取，取5 mL提取液過固相萃取柱，在優化后的儀器條件下，23種磺胺類藥物在線性范圍0.2~20 ng/mL上具有良好的線性關系，檢出限為0.1~2.0 μg/kg，定量限為0.25~5.0 μg/kg，在低、中、高3個加標水平下上平均回收率為66.12%~99.83%，RSD為0.72%~10.36%，本方法操作簡單、靈敏度高，適用于雞肉中多種磺胺類藥物殘留的檢測。