Plackett-Burnman聯(lián)合響應(yīng)面法優(yōu)化黑果枸杞黃酮提取工藝及抗氧化性研究

王春林，武 蕓，蘆婭妮，韓明虎，王麗朋，胡浩斌

（1.隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽 745000；2.隴東學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅慶陽 745000）

黑果枸杞具有抗炎[1]、增強(qiáng)腸道屏障功能[2]、抗氧化[3?6]、抗疲勞[7?8]、防痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[9]、抗動脈粥樣硬化[10]、防治心腦血管疾病[11]等功效，富含花青素、多糖、多酚、黃酮等多種天然有效成分，主產(chǎn)于我國新疆、甘肅、青海、寧夏等地[12]。黃酮類化合物（Flavonoids）是一類植物次生代謝產(chǎn)物，其抗氧化性是化學(xué)合成抗氧化劑的3~5倍，天然無毒，極具開發(fā)前景[13]。李淑珍[14]以新疆產(chǎn)黑果枸杞葉為原料，測定了其總黃酮含量并優(yōu)化了提取工藝，使總黃酮提取率達(dá)到了0.23%。段亞云等[15]、韓愛芝等[16]分別采用響應(yīng)面技術(shù)優(yōu)化了超聲波-微波協(xié)同提取、超聲輔助提取黑果枸杞葉總黃酮的工藝條件，提取率分別達(dá)到了0.997%和1.62%。古麗巴哈爾·卡吾力等[17]以新疆塔里木盆地產(chǎn)黑果枸杞為原料，采用水提法，通過單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面法優(yōu)化了黑果枸杞黃酮提取工藝，總黃酮提取量達(dá)到了69.02 μg/mL。同時(shí)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)黑果枸杞黃酮具有明顯的體外抗氧化性[17?18]、降血脂功效[19?20]、抑制Hep G-2肝癌細(xì)胞增殖作用[21?22]。綜上所述，關(guān)于黑果枸杞總黃酮提取及生物活性研究，多見于新疆產(chǎn)黑果枸杞葉中的黃酮類化合物，其它主產(chǎn)區(qū)數(shù)據(jù)尚缺，從黑果枸杞果實(shí)中提取黃酮化合物的報(bào)道也較為少見。

植物有效成分提取中需考慮到多個(gè)影響因素，通常的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)導(dǎo)致工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力且優(yōu)化工藝具有盲目性、缺乏精準(zhǔn)性。Plackett-Burman（PB）是一種近飽和的兩水平篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能用最少的試驗(yàn)次數(shù)快速有效地篩選出顯著性影響因子[23]，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)可依據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定爬坡方向，快速聚焦響應(yīng)面中心區(qū)域，Box-Behnken（BB）響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用多元線性和二次項(xiàng)模型擬合，可較好地體現(xiàn)依賴變量與非依賴變量之間的關(guān)系，對回歸方程分析尋求最佳工藝參數(shù)[24]。

本研究以甘肅產(chǎn)黑果枸杞干果為原料，采用超聲輔助提取其總黃酮，通過PB、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)及BB聯(lián)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對其抗氧化性進(jìn)行了評價(jià)，一方面可為黑果枸杞研究填補(bǔ)數(shù)據(jù)空白，有利于黑果枸杞資源開發(fā)利用，另一方面為植物有效成分提取工藝研究提供可供參考的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞 2018年6月至8月產(chǎn)自甘肅省民勤縣；抗壞血酸（批號Lot.No 1018P032）、DPPH（批號Lot.No 102D021）、ABTS（批號Lot.No 109A021）

北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鉀、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、過硫酸鉀 均為分析純。

FZ102微型植物試樣粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；7230G可見分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑果枸杞黃酮提取方法 黑果枸杞原料經(jīng)30 ℃鼓風(fēng)干燥48 h、粉碎，取100目標(biāo)準(zhǔn)篩篩下物，干燥器中?5 ℃保存。準(zhǔn)確稱取0.5 g，置于裝有15 mL 51%乙醇的錐形瓶中，62 ℃下提取42 min，超聲功率240 W，冷卻至室溫后離心分離，取上層清液于25 mL容量瓶中，蒸餾水定容。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以黑果枸杞總黃酮提取率（Total flavonoids content，TFC）為評價(jià)指標(biāo)，各因素考察參數(shù)及固定水平如表1所示。

表 1 單因素實(shí)驗(yàn)各因素考察參數(shù)及固定水平Table 1 Parameters and fixed level of each factor in single factor experiments

1.2.3 PB實(shí)驗(yàn)-最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別對每個(gè)影響因子取高低兩水平通過Minitab 17.1.0軟件進(jìn)行PB篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取的因素及水平見表2。其次，在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分析實(shí)驗(yàn)所得一次多項(xiàng)式及各因素的正負(fù)效應(yīng)，確定爬坡方向和步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表 2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素及水平Table 2 Factors and levels tested in PB design

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，聚焦響應(yīng)面中心區(qū)域，選取顯著性因素及水平，非顯著性影響因素保持單因素實(shí)驗(yàn)中最高提取率對應(yīng)值，液料比30:1 mL/g，超聲功率240 W，見表3，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及優(yōu)化分析。

表 3 響應(yīng)面因素及水平Table 3 Factors and levels in response surface design

1.2.5 總黃酮提取率測定 將提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)作為測試液。參照課題組前期研究成果中的方法測定總黃酮濃度，并根據(jù)式（1）計(jì)算黃酮提取率，提取率以mg/g（原料）表示，后面簡寫為mg/g[25]。

式中：ρ：總黃酮提取率，mg/g；C：測試液總黃酮濃度，μg/mL；DF：稀釋倍數(shù)，50；m：原料質(zhì)量，g；V：提取液體積，25 mL；1000：單位換算系數(shù)。

1.2.6 黑果枸杞黃酮抗氧化性測定 參考Pavli?等[26]與Sarikurkcy等[27]的方法并根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)稍作修改。抗壞血酸與黃酮保持相同濃度和方法做平行對比。

1.2.6.1 FRAP實(shí)驗(yàn) 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL的樣品測試液。2.5 mL磷酸緩沖液（pH=6.6）及1%鐵氰化鉀溶液加入1 mL測試液中，混合、50 ℃水浴中保持20 min后，常溫下加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，離心分離、取上層清液2.5 mL，與2.5 mL蒸餾水與0.1%氯化鐵溶液混合，靜置，測定700 nm的吸光度。

1.2.6.2 ABTS實(shí)驗(yàn) 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的樣品測試液。將7 mmol ABTS與140 mmol過硫酸鉀按5 mL:88 μL混合，室溫下暗處放置12~16 h，形成ABTS自由基儲備液，避光保存，使用時(shí)稀釋為A734 nm在0.695~0.705范圍即可。測定時(shí)，取300 μL配制好的樣品溶液或抗壞血酸溶液與3.7 mL ABTS自由基稀釋液，混合、靜置，測定734 nm的吸光度。

1.2.6.3 DPPH實(shí)驗(yàn) 將黑果枸杞黃酮提取液稀釋至濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL的樣品測試液。取0.5 mL測試液及4.0 mL DPPH無水乙醇溶液（0.15 mmol/L）于帶刻度具塞試管中，用無水乙醇稀釋至6 mL，混勻、避光放置一定時(shí)間，測定517 nm的吸光度。采用相同的方法分別測定用無水乙醇代替DPPH溶液和4.0 mL DPPH溶液與2.0 mL無水乙醇的混合液在517 nm的吸光度。同法評價(jià)抗壞血酸DPPH自由基清除能力。

ABTS與DPPH自由基清除率均采用式（2）計(jì)算。

式中：S為清除率；Ai為測試液吸光度；Aj為樣品溶液吸光度；A0為未加樣品對照液吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件作圖、Mintab 17.1.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)差異比較、Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及優(yōu)化分析與統(tǒng)計(jì)差異比較，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖1可以看出，50%乙醇溶液對黑果枸杞黃酮的提取率最高，推測其與黑果枸杞黃酮極性最相似；提取時(shí)間40 min時(shí)，黃酮提取率不再增加，繼續(xù)延長提取時(shí)間提取率變化不大；提取溫度太低不利于傳質(zhì)，太高則會破壞黃酮結(jié)構(gòu)、降低其生物活性，70 ℃較佳；當(dāng)液料比達(dá)到30:1（mL/g）時(shí)，黑果枸杞黃酮溶出量最大，再增大溶劑用量，會導(dǎo)致溶出雜質(zhì)增多，降低總黃酮在溶出物中的比例而使其純度下降；超聲功率240 W時(shí)提取效果較佳。因此，較佳的提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間40 min、提取溫度70 ℃、液料比30:1 mL/g、超聲功率240 W，以其為參考值進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖 1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single factor experiment

2.1.2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 按前述方法進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各組實(shí)驗(yàn)提取率如表4所示。

表 4 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 PB experimental design and results

采用Minitab 17.1.0軟件對PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與模型擬合，結(jié)果見表5。

由表5可知，模型的“P<0.001”、F=41.53，說明實(shí)驗(yàn)擬合模型達(dá)到了0.1%顯著水平；從相關(guān)系數(shù)來看，R2=0.9719，R2（predicted）=0.8877，R2（adjusted）=0.9485均與1接近，說明擬合得到的一次多項(xiàng)式Y(jié)=31.519?1.548A?2.711B+2.619C+0.531D+0.301E與實(shí)驗(yàn)基本相符，可用來判別各種影響因素的顯著性。表6為各因素的正負(fù)效應(yīng)系數(shù)、顯著性數(shù)值及影響排名。

2.1.3 最陡爬坡試驗(yàn) 由表7可知，第5組提取率最高，所以以第5組實(shí)驗(yàn)對應(yīng)的顯著性影響參數(shù)為響應(yīng)面中心進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

表 5 PB實(shí)驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis results of PB design

2.1.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式TFC=40.98+0.17A?0.29B+0.20C+0.40AB+0.28AC?0.95BC?1.57A2?1.03B2?1.38C2，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表8和表9。

由表9可知，模型F=50.50，P<0.0001，說明模型達(dá)到了0.1%顯著水平，并且R2=0.9848，R2adj=0.9653，R2pred=0.9040、失擬項(xiàng)P=0.6199>0.05，說明模型預(yù)測性良好且失擬程度不顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，各項(xiàng)顯著性因素統(tǒng)計(jì)分析表明，其顯著性大小順序?yàn)椋築>C>A，這與Plackett-Burnman試驗(yàn)分析結(jié)果一致，結(jié)論相互佐證，說明實(shí)驗(yàn)過程誤差小，并且B，AB達(dá)到了5%顯著性水平，BC，A2，B2，C2等二次項(xiàng)達(dá)到了0.1%顯著性水平。

表 6 各因素的正負(fù)效應(yīng)及顯著性Table 6 Positive and negative effects and significance of each factor

表 7 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Experimental design and result in steepest ascent method

表 8 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Experimental design and results in Box-Behnken

表 9 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 ANOVA results of Box-Behnken design

依據(jù)數(shù)據(jù)模擬結(jié)果，繪制3D響應(yīng)面圖，見圖2。由圖2可知，所形成的響應(yīng)曲面均中心凸起四周下降，說明通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)選取的響應(yīng)面中心準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)中選取各因素水平范圍覆蓋了最高提取率的工藝條件，通過模型預(yù)測的最佳提取工藝是科學(xué)合理的。

圖 2 響應(yīng)面3D圖Fig.2 Response surface 3D graph

2.1.5 最優(yōu)條件及驗(yàn)證 解析所得二次多項(xiàng)式，并根據(jù)儀器實(shí)際操作精確度做近似處理，得到超聲輔助提取黑果枸杞黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)51%，提取溫度62 ℃，提取時(shí)間42 min，液料比30:1，超聲功率240 W，并進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平均提取率為42.0974 mg/g，與預(yù)測值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.24%，說明該擬合模型可靠、最佳工藝條件準(zhǔn)確。

2.2 黑果枸杞黃酮抗氧化性

2.2.1 FRAP還原力 由圖3可知，隨著黑果枸杞黃酮樣品與抗壞血酸濃度增大，吸光度逐漸增大，說明其還原力增強(qiáng)，并且黑果枸杞黃酮的還原力強(qiáng)于抗壞血酸，與李進(jìn)等[18]報(bào)道的黑果枸杞葉黃酮還原力實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，但吸光度整體偏小，可能由于黑果枸杞黃酮來自不同地域的植物和植物不同部位而表現(xiàn)出差異，同時(shí)推測黑果枸杞黃酮是良好的電子供應(yīng)者。

圖 3 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的還原力Fig.3 Reducing power of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid

2.2.2 ABTS總抗氧化力 由圖4可知，黑果枸杞總黃酮與抗壞血酸對ABTS+自由基的清除率均隨自身濃度增大而增大，在0.05 mg/mL時(shí)，黑果枸杞黃酮與抗壞血酸的清除率分別達(dá)到96.68%和93.63%，說明黑果枸杞黃酮與抗壞血酸均具有很強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，IC50分別為0.0252 、0.0279 mg/mL，說明黑果枸杞黃酮的ABTS+自由基清除力略強(qiáng)于抗壞血酸。原因可能是黃酮類化合物具有多羥基，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)中的3-OH，5-OH，2、3位雙鍵，B環(huán)中的4'-OH，3'，4'鄰位雙羥基是抗氧化的有效基團(tuán)，能與自由基反應(yīng)，形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基，共振半醌式自由基的穩(wěn)定性越大，黃酮類化合物的抗氧活性越強(qiáng)[28]。

圖 4 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的ABTS+自由基清除能力Fig.4 ABTS+· scavenging force of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid

2.2.3 DPPH自由基清除能力 穩(wěn)定自由基DPPH的乙醇溶液呈紫色，在517 nm處有最大吸收，抗氧化劑具有遞電子或遞質(zhì)子的能力，對DPPH自由基的清除作用是抗氧化劑將電子或質(zhì)子傳遞給DPPH自由基，從而生成穩(wěn)定的分子態(tài)的結(jié)果[29]。由圖5可知，黑果枸杞黃酮與抗壞血酸清除DPPH自由基作用均較強(qiáng)，IC50分別為0.0272、0.0287 mg/mL。濃度0.01~0.06 mg/mL時(shí)，兩者對DPPH自由基清除率隨濃度增大急劇上升，達(dá)到0.06 mg/mL時(shí)，兩者的清除率都大于90%并趨于穩(wěn)定，此后清除作用增加不明顯，整個(gè)過程二者對DPPH自由基的清除率無明顯差異，本實(shí)驗(yàn)中的黃酮樣品對DPPH自由基的清除能力低于古麗巴哈爾·卡吾力等[17]報(bào)道的新疆黑果枸杞黃酮，與李兆君等[30]報(bào)道的寧夏黑果枸杞黃酮清除能力基本一致。

圖 5 黑果枸杞黃酮及抗壞血酸的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH· scavenging force of Lycium ruthenicum Murr.polyphenols and ascorbic acid

3 結(jié)論

本研究以甘肅產(chǎn)黑果枸杞為原料，采用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)聯(lián)合最陡爬坡實(shí)驗(yàn)與BB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行黃酮提取工藝優(yōu)化，最佳提取工藝條件為：以51%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）為提取劑，加入與原料比30:1（mL/g）的量，62 ℃、240 W提取42 min，提取率可達(dá)42.0974 mg/g。

同時(shí)，以抗壞血酸為陽性對照，較全面地評價(jià)了黑果枸杞黃酮的抗氧化性，得出黑果枸杞黃酮具有較強(qiáng)的還原力，對ABTS+自由基、DPPH自由基的清除作用表明，其IC50分別為0.0252、0.0272 mg/mL均略強(qiáng)于抗壞血酸的0.0279、0.0287 mg/mL，抗氧化能力與濃度正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中對抗氧化性考察的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有限，本課題組會在后續(xù)研究中繼續(xù)探索黑果枸杞黃酮對其它自由基的清除作用，采用HPLC或MS對提取物黃酮單體化合物進(jìn)行定性定量研究。

綜上所述，黑果枸杞黃酮可作為一種安全的天然抗氧化物，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和潛在經(jīng)濟(jì)效益，本文研究成果可為黑果枸杞開發(fā)應(yīng)用、深加工、精加工提供一定的理論依據(jù)。