茶梗可溶性膳食纖維的制備工藝優化及單糖組成和理化特性研究

葉秋萍，林麗霞，洪翠云，林志平

（1.福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建廈門 361006；2.廈門市同安區恒利茶葉有限公司，福建廈門 361100）

膳食纖維（dietary fiber, DF）被稱為人類的第七大營養素，是一類不能被人體消化酶消化、也不能被小腸吸收的以多糖為主的高分子物質的總稱，主要成分包括纖維素、半纖維素、木質素及樹膠、果膠、粘質等[1]。膳食纖維根據溶解性，可分為不溶性膳食纖維（IDF）和可溶性膳食纖維（SDF）[2]。研究發現膳食纖維具有降三高、緩解便秘、改善腸道菌群、預防肥胖癥、預防糖尿病、動脈硬化、高脂血癥、預防腫瘤、抗氧化等生理功能[3?7]。膳食纖維主要來源于谷物類、豆類、玉米、水果類、蔬菜類、中藥材等[8?12]，廣泛應用于食品加工業中對食品進行增稠和填充[13]。

目前膳食纖維的制備方法主要有化學法、酶法、發酵法、膜分離法及多方法輔助提取法等[14]，化學法一般采用酸堿試劑進行浸提處理[15]，雖然制備膳食纖維的得率較高，但生產過程易產生污染，且膳食纖維的生物活性降低；酶法制備膳食纖維工藝溫度較低、污染少、產品無溶劑殘留，但是酶制劑成本較高，適用于含有高含量淀粉和蛋白質的原料制備膳食纖維[16]；膜分離法由于對設備和分離技術的要求較高，難以實現大生產[17]。發酵法是利用微生物發酵提供的酸性環境，產生的酶類使原料中的成分如蛋白質、脂肪、淀粉等發生反應分解，獲得膳食纖維的方法[18]。該法能有效促進IDF（不可溶膳食纖維）向SDF（可溶性膳食纖維）轉化，提取的膳食纖維實用性和生物活性較高，目前用得較多的菌種有乳酸菌和綠色木霉，而綠色木霉具有菌體生長較快、產酶周期短的優越性[19]。熊俐等[20]采用綠色木霉制備黃豆渣膳食纖維，發現pH為5，發酵時間108 h，溫度32 ℃，裝液量115 mL/250 mL，接種量10%，二次發酵后，水溶性膳食纖維的含量顯著提高、得率為12.03%，產品的感官品質較佳，且持水力為10.31 g/g，膨脹力為11.21 mL/g。徐靈芝等[21]采用綠色木霉制備雷竹筍渣膳食纖維，研究發現料液比10:1、發酵時間60 h、接種量6%、溫度32 ℃、pH為5.8，膳食纖維的得率為79.33%，顯著改善了膳食纖維的持水力、溶脹力和結合水力等理化品質。Jia等[22]采用綠色木霉發酵米糠制備SDF，發現發酵后的米糠SDF的水合性有明顯提高。

我國是世界主要的產茶國之一，產量居世界首位。然而在茶葉精制過程中會產生大量的茶梗、茶末等副產物，其中茶梗約占茶葉毛重的30%。目前有采用酸法[23]、堿法[24]和酶法[25]制備茶渣水不溶性膳食纖維，采用酶法制備茶渣可溶性膳食纖維[26]，堿法提取茶末水溶性膳食纖維[27]，乳酸菌發酵法制備茶渣可溶性膳食纖維[18]。膳食纖維是茶梗的主要組成成分，但目前對采用發酵法制備茶梗水溶性膳食纖維未見報道。本文擬以茶梗為原料，采用綠色木霉發酵法制備可溶性膳食纖維，獲得最佳工藝參數，并分析其主要性能指標，為提升茶梗的附加值開拓新的渠道。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

茶梗（安溪鐵觀音） 置于70 ℃烘箱中干燥1 h，混勻、粉碎過40目篩；綠色木霉 菌株號為GDMCC3.141 廣東省微生物菌種保藏中心；95%乙醇、磷酸二氫鉀、硫酸銨 均為分析純，西隴科學股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖水、馬鈴薯葡萄糖瓊脂 廣東環凱微生物科技有限公司。

HVA-85 高壓滅菌器 日本平山制作所株式會社；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；DNP-9162型培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；DHG-9240A恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；Agilent 1200液相色譜儀

美國Agilent；XL30ESEM電鏡 飛利浦公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備工藝

1.2.1.1 工藝流程

1.2.1.2 發酵劑的制備 菌種活化：將綠色木霉菌株的干粉用0.1~0.2 mL的培養液或者無菌水溶解，接種至馬鈴薯培養基斜面上，在28 ℃下培養7 d；用無菌水將孢子洗下，適度稀釋，進行擴大培養；接種菌種至馬鈴薯汁培養基中，在30 ℃下培養24 h，活化2次，形成孢子懸液。

菌種馴化：將獲得的孢子懸液接種至茶梗汁混合液于30 ℃下培養24 h，馴化2次；再接種至茶梗汁混合液于30 ℃下培養24 h，綠色木霉菌總數達到107~108cfu/mL，作為發酵劑。

1.2.1.3 膳食纖維制備 將稱量好的茶梗粉裝入三角瓶中，加入硫酸銨0.3 g、磷酸二氫鉀0.325 g、純水100 mL，調節pH，于121 ℃下滅菌20 min，冷卻；將發酵劑接種到滅菌后的茶梗培養液中培養；將發酵液抽濾，濾液加入4倍體積95%乙醇，靜置3~5 h，置于轉速為5000 r/min的離心機中離心10 min、過濾，將沉淀物置于70 ℃下烘干5~7 h至干燥、粉碎，獲得膳食纖維。

1.2.2 單因素實驗 恒定茶梗粉重量為10g，分別研究不同發酵劑接種量（1%、2%、4%、6%、8%）、時間（24、36、48、60、72 h）、溫度（26、28、30、32、34 ℃）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）等因素對茶梗SDF得率的影響。

1.2.2.1 發酵劑接種量的影響 稱取茶梗粉10 g，在發酵時間為60 h、發酵溫度為30 ℃、pH5.0下，分別采用不同發酵劑接種量1%、2%、4%、6%、8%進行制備，計算茶梗SDF得率。

1.2.2.2 時間的影響 稱取茶梗粉10 g，在發酵溫度為30 ℃、發酵劑接種量為4%、pH5.0下，分別采用不同發酵時間24、36、48、60、72 h進行制備，計算茶梗SDF得率。

1.2.2.3 溫度的影響 稱取茶梗粉10 g，在發酵時間為60 h、發酵劑接種量為4%、pH5.0下，分別采用不同發酵溫度26、28、30、32、34 ℃進行制備，計算茶梗SDF得率。

1.2.2.4 pH的影響 稱取茶梗粉10 g，在發酵時間為60 h、發酵劑接種量為4%、發酵溫度為30 ℃下，分別采用不同pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0進行制備，計算茶梗SDF得率。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗基礎上，以發酵劑接種量、時間、溫度、pH為考察因素，以SDF得率為考察指標，進行四因素三水平L9（34）正交實驗設計，篩選發酵法制備膳食纖維的最佳條件，實驗因素及水平設計見表1。

表 1 四因素三水平正交試驗表Table 1 Orthogonal test table of four factors and three levels

1.2.4 測定項目與計算方法

1.2.4.1 可溶性膳食纖維（SDF）得率計算

1.2.4.2 微觀結構觀察 將樣品干燥至質量恒定，取適量黏合在樣品臺上，利用離子濺射法對樣品進行鍍膜，然后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.4.3 單糖組成檢測方法 樣品前處理方法：稱取適量制備的可溶性膳食纖維樣品于100 mL錐形瓶中，加水，緩慢加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，室溫振蕩1 h，離心，用干燥濾紙過濾，定容。

完全酸水解：取1 mL樣品，加入4 mol/L三氟乙酸溶液1.0 mL，在120 ℃條件下水解120 min。70 ℃水浴，氮吹儀吹干。

PMP衍生化：向水解干燥后得到的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮試劑和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混勻后，水浴70 ℃反應30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 0.5mL，充分混勻。加入1 mL氯仿。充分振蕩萃取，去除氯仿層，共萃取三次。水層用0.22 μm濾膜過濾后，待上機。

檢測條件：Agilent 1200液相色譜儀，色譜柱：Thermo C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動 相為0.1 mol/L pH6.7磷酸鹽緩沖溶液:乙腈=83:17（v/v）流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為 10 μL；波長為250 nm。

1.2.4.4 持水率測定 稱取2 g膳食纖維粉放入燒杯中，然后加入150 mL蒸餾水，攪拌均勻，靜置2 h后，將纖維用快速濾紙濾去多余水分，把保留在濾紙上的濕樣品轉移到表面皿中稱重，再將表面皿放入110 ℃的烘箱中，烘烤至恒重，在干燥器中冷卻后稱重，計算持水率[28]。

1.2.4.5 膨脹率測定 準確稱取制備的膳食纖維粉0.1 mg置于量筒中，準確吸取5 mL蒸餾水加入其中，振蕩均勻后室溫放置24 h，讀取量筒中膳食纖維的體積，計算膨脹率[28]。

1.2.4.6 清除DPPH自由基能力測定 在2.0 mL樣品液（接種量為6%，時間為60 h，溫度為30 ℃，pH為5.0下制備的膳食纖維）中加入2.0 mL的DPPH溶液（0.1 mmol/L，無水乙醇配制），充分混合后避光反應 30 min，最后于517 nm處測吸光值（A1）。同時測定2.0 mL的DPPH溶液（0.1 mmol/L）與2.0 mL 95%乙醇混合液的吸光度（A2），以及2.0 mL相應濃度的樣液與2.0 mL無水乙醇混合液的吸光度（A3）。用95%乙醇代替反應液作空白對照[29]。以抗壞血酸作為對照。清除率計算公式為：

1.2.4.7 還原能力測定 取0.1 mL樣品溶液，加入1.5 mL磷酸鹽緩沖溶（0.2 mol/L、pH6.6）和1.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，搖勻，50 ℃反應20 min后加入1.5 mL 10%的三氯乙酸溶液終止反應，再加入3 mL去離子水和0.6 mL 0.1%的氯化鐵，搖勻后于700 nm處測吸光值，反應液中以0.6 mL蒸餾水代替0.1%的氯化鐵做空白，以抗壞血酸作為對照。吸光度越大，樣品的還原能力越大，亦即抗氧化性越強[29]。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010 處理數據，結果以平均值±標準差表示，試驗重復三次；采用SPSS19.0軟件對數據進行顯著性分析，利用單因素ANOVA和Duncan多重比較分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 茶梗粉SDF制備單因素實驗結果

2.1.1 不同發酵劑接種量對SDF得率的影響 考察發酵過程不同發酵劑接種量下SDF得率的變化，結果如表2所示。由表2可知，SDF得率隨發酵劑接種量增加呈先增加后減小的趨勢。當接種量為4%時，SDF的得率最高達到7.09%，極顯著高于其他處理（P<0.01)，說明該接種量下綠色木霉能很好地分解膳食纖維；發酵液中營養物質是恒定的，隨著接種量的增加，不能為綠色木霉菌提供充足的營養，導致發酵產生的酶不能完全分解茶梗中的膳食纖維，使得得率減少。因此，適宜的發酵劑接種量為4%。

表 2 不同發酵劑接種量對SDF得率的影響Table 2 Effect of inoculums of starter culture on SDF yield

2.1.2 不同時間對SDF得率的影響 考察發酵過程不同發酵時間下SDF得率的變化，結果如表3所示。

表 3 不同時間對SDF得率的影響Table 3 Effect of different time on SDF yield

由表3可知，隨著發酵時間的延長，SDF得率先是出現了快速增長，當達到60 h時，得率達到了最大值7.16%，極顯著高于其他處理（P<0.01)，說明此時發酵液中由綠色木霉發酵產生的酶活力最強，能較好的分解產生SDF；而后時間增加SDF得率出現了下降趨勢，可能是由于發酵時間太長，活菌活力降低，死亡菌增多，失活的菌體被留在茶梗粉中，從而影響了得率[30]，這與熊俐等[20]采用綠色木霉發酵制備黃豆渣膳食纖維的趨勢相同。因此，選擇60 h作為發酵的最佳時間。

2.1.3 不同溫度對SDF得率的影響 考察發酵過程不同發酵溫度下SDF得率的變化，結果如表4所示。由表4可知，隨著溫度的上升，SDF得率出現了先增加后減少的趨勢，當溫度達到30 ℃時，SDF得率最高達到7.36%，極顯著高于其他處理（P<0.01)，說明該溫度下綠色木霉菌體生長良好，能很好地分解茶梗中的膳食纖維；溫度較低綠色木霉菌生長緩慢，從而影響了發酵；溫度太高也會抑制菌體生長，從而減少了酶的生成導致SDF得率下降。30 ℃處理的得率最高且較為節能，說明30 ℃為最佳發酵溫度。對比發現，32和34 ℃處理下SDF得率極顯著高于28 ℃處理（P<0.01)，所以選用發酵溫度為30、32和34 ℃這三個水進行后續考察。

2.1.4 不同pH對SDF得率的影響 考察發酵過程不同pH下SDF得率的變化，結果如表5所示。由表5可知，隨著pH的增加，SDF得率逐漸增加，當pH達到5.0時，得率最高達到7.11%，極顯著高于其他處理（P<0.01)，pH繼續增加而得率則出現下降，說明pH過高或過低都不利于綠色木霉生長，不利于酶的產生，從而影響了SDF的產出。因此，選擇pH為5.0為最佳發酵pH。

表 4 不同溫度對SDF得率的影響Table 4 Effect of different temperature on SDF yield

表 5 不同pH對SDF得率的影響Table 5 Effect of different pH value on SDF yield

2.2 正交試驗

根據單因素實驗結果，為進一步優化發酵條件，對發酵劑接種量、時間、溫度和pH設計了四因素三水平L9（34）正交試驗，結果如表6所示。由表6可知，處理8的SDF得率極顯著高于其他處理（P<0.01)，結合正交結果分析發現影響發酵過程SDF得率各因素主次順序為：A>C>D>B，即接種量>溫度>pH>時間，最優的發酵工藝參數組合為：A3B2C1D2，即接種量為6%，時間為60 h，溫度為30 ℃，pH為5.0，進一步做驗證試驗，重復三次，測得SDF的平均得率為7.15%，與正交試驗處理8的得率相接近，略低于單因素試驗的最高得率7.36%，主要是因為接種量有所增加導致發酵產生的酶不能完全分解茶梗中的膳食纖維，使得得率略有下降。

表 6 正交試驗結果Table 6 Orthogonal test results

2.3 茶梗SDF微觀結構觀測

采用掃描電鏡觀測茶梗SDF表面形態特征，觀測其微觀結構變化，研究茶梗SDF表面形態結構對其水合性能的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，茶梗和發酵后茶梗SDF采用掃描電鏡放大10000倍后發現，茶梗表面結構較為光滑、結構緊密，而發酵后茶梗SDF顆粒表面凹凸不平，成疏松多孔的結構，且形成斷層結構，前人研究發現SDF的水合性能和對葡萄糖的吸收能力與膳食纖維的多孔結構有關[31]。這些孔隙有利于擴大SDF顆粒的表面積，有利于SDF吸附更多的水分子和油分子[32]，對提高SDF的持水率和膨脹率有積極的促進作用。

圖 1 茶梗SDF掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope (SDF) of tea stalk

圖 2 茶梗SDF的單糖組成高效液相色譜圖Fig.2 High-performance liquid chromatography of monosaccharide composition in SDF of tea stalk

2.4 茶梗SDF 單糖組成分析

為進一步分析制備的茶梗SDF的單糖組分分布，采用高效液相色譜進行檢測，結果如圖2、表7所示。由圖2、表7可知，茶梗SDF主要由10種單糖組成，包括甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖。其中半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖含量較高，分別為2766.23、2721.37和1905.82 mg/kg，這三種糖是果膠類物質的主要成分，而果膠類物質屬于可溶性膳食纖維中。這與咖啡皮制備的SDF中果膠單糖主要成分為半乳糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖的結果相近[33]。而木糖、核糖和葡萄糖等含量較低，主要是淀粉和纖維素水解得到的[17]。因此，發酵法制備的茶梗SDF中支鏈較少的果膠單糖含量較高，其水溶性較好。

2.5 茶梗SDF理化性質分析

可溶性膳食纖維理化性質是衡量其生理活性好壞的標準，對發酵前后茶梗SDF的持水率、膨脹率、清除DPPH自由基等指標進行測試，結果如表8所示。由表8可知，制備的茶梗SDF的持水率和膨脹率大于茶梗中的，說明采用綠色木霉發酵有利于增加SDF親水性基團，具有很強的水合作用[34]，這也有可能是由前面研究發現的茶梗SDF具有多孔隙的微觀結構及含有較高含量的果膠單糖所引起的。茶梗SDF的持水率549.20%高于采用酵母菌發酵制備的麩皮SDF的持水率432%[35]，高于脫脂椰蓉SDF的持水率380%和膨脹率3.1 mg/L[36]、高于酶解和堿處理相結合的茶梗SDF的持水率509.57%和膨脹率4.20 mg/L[37]，這可能是因為綠色木霉發酵能使茶梗的粒度減小、比表面積增大[38]，并且可能引起非水溶性膳食纖維分子中親自基團暴露率增大[35]，從而提高發酵后茶梗SDF的持水率和膨脹率。清除DPPH自由基和還原能力是表征可溶性膳食纖維抗氧化強弱的指標。由表8可知，茶梗SDF的DPPH自由基清除率12.41%高于茶梗11.63%，高于豆渣中SDF-1（1倍乙醇）和SDF-3（3倍乙醇）[38]，且茶梗SDF的還原能力為14.71%，也高于發酵前茶梗中的9.20%，說明采用綠色木霉發酵法制備的茶梗SDF具有一定的抗氧化活性。

表 7 茶梗SDF的單糖含量Table 7 Content of monosaccharide in SDF of tea stem

表 8 發酵前后茶梗中SDF的理化性質Table 8 Physicochemical properties of SDF in tea stalks before and after fermentation

3 結論

采用發酵法制備茶?？扇苄陨攀忱w維，通過單因素實驗及正交試驗法對工藝參數進行優化，獲得最佳工藝參數為：綠色木霉菌接種量為6%，發酵時間為60 h，發酵溫度為30 ℃，pH為5.0，該條件下茶梗SDF的得率為7.15%。該法制備的茶梗SDF色澤均勻、呈姜黃色的粉末，與酸堿法、酶法等工藝相比，具有綠色環保、無溶劑殘留的特點。

在10000倍掃描電鏡下觀測茶梗SDF，發現顆粒表面凹凸不平，成疏松多孔的結構。采用高效液相色譜儀測定SDF中的單糖組成，含量較高的組分主要是支鏈較少的多糖組分包括半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖，屬于果膠類物質。而具有多孔的結構及含量較高果膠單糖的茶梗SDF能更好地吸附水分子。經檢測SDF的持水率達到549.20%，膨脹率為5.22 mg/L，清除DPPH自由基能力為12.41%，還原能力為14.71%，表明其具有較好水合性能，且水合性能和抗氧化性能均優于原料，這與結構觀測及色譜測定結果相一致。因此，采用發酵法制備茶?？扇苄陨攀忱w維為拓寬茶葉副產物的綜合開發利用提供了有效渠道，有利于提高其附加值。將可溶性膳食纖維添加到食品中不僅可改善其結構性能、口感感覺，還有利于促進人體健康。