不同處理方式復合菌固體發酵野生構樹葉制備蛋白飼料的工藝優化

吳鵬濤，李杭慶，李 琛，李 鵬，王珍珍，章亭洲，葛 青,, ，毛建衛,3,

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江省農業生物資源生化制造協同中心，浙江杭州 310023；2.浙江科峰生物科技有限公司，浙江嘉興 314000；3.浙江工業職業技術學院，浙江紹興 312000）

隨著生活水平的提高，人們對肉制品的需求量日益劇增，從而促使了畜牧業的快速發展。目前，作為飼料資源的餅粕、牧草及常規飼料糧的供需缺口已經越來越大。需要發展新型飼料來填補空缺，而構樹（Broussonetia papyrifera）是一種優質的非常規蛋白飼料資源，具有極強的適應性和抗逆性，廣泛分布于我國黃河、長江及珠江流域，是一種多功能綜合性經濟樹種，應用于造紙、飼料、醫藥等行業[1?2]。雖然構樹葉含有豐富的粗蛋白，但是因為抗營養因子的存在，動物不能完全吸收利用構樹葉飼料。研究表明構樹葉中的抗營養因子主要為單寧[3]。單寧能與生物堿、核酸、脂質、蛋白質等生物大分子發生很強的復合作用，從而阻礙這些物質的生物降解[4]。單寧與生物大分子的這種結合會對動物產生許多不利影響，例如與動物口腔中唾液蛋白結合，產生苦澀味道；與動物細胞膜上的蛋白質、磷脂和多糖等成分結合，使動物細胞膜通透性改變；與蛋白質結合，降低動物對飼料的消化率[5?7]。Teixeira等[8]發現用部分高粱（高粱主要抗營養因子為單寧）代替大米進行飼養成犬，消化率明顯降低。Omnes等[9]飼喂10 g/kg含單寧日糧的魚類其蛋白質消化率明顯低于飼喂對照日糧的魚類，添加單寧到魚飼料中，單寧攝入可顯著降低累積采食量、生長、飼料和蛋白質效率、表觀消化系數、肝體指數和胴體脂類。

目前，降低抗營養因子單寧有很多途徑。通過物理、化學、生物和其他方法處理來削弱單寧的抗營養性。現有研究表明，通過微生物來降解植物飼料中的單寧，不僅對單寧的去除高效徹底，而且成本較低、不污染環境，是解決其抗營養性的有效途徑[10]。微生物對單寧的降解主要通過兩種途徑來實現：一是微生物向細胞外分泌可以和單寧高度親和的物質，使其不能與生物體內維持生命所必需的物質相結合；二是分泌可使單寧降解的酶類并作用于單寧，使其轉化成微生物生長所需要的物質和能量[11]。

蒸汽爆破預處理主要是利用高溫高壓蒸汽，通過瞬間釋放壓力過程，實現原料的組分離散和結構變化[12]。汽爆使接觸面積增大，更有利于發酵。應用球磨技術，可將各類構樹葉加工成超細粉，具有很好的固香性、分散性和溶解性，特別容易消化吸收，能最大限度地利用原料、節約資源。楊華等[13]通過高壓蒸汽爆破處理使秸稈的木質纖維素結構得到改變，結合有益菌發酵顯著提高了秸稈的營養價值。本文旨在研究不同處理方式復合菌固體發酵構樹葉制備蛋白飼料的工藝條件優化，并跟蹤發酵過程中酶活力和微生物生長情況。實驗為后續構樹葉作為非常規飼料投入生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

構樹葉 采自于杭州市西湖區浙江科技學院，曬干磨粉過20目篩；釀酒酵母菌BY4741、乳酸菌JI2176、枯草芽孢桿菌KD-N2 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室提供；沒食子酸（分析純）

國藥集團化學有限公司；無水碳酸鈉（分析純） 天津市化學試劑研究所有限公司；乙醇、單寧酸等（以上均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚（分析純） 上海長哲生物科技有限公司；胰蛋白胨、蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉等（以上均為生物試劑） 北京奧博星生物技術有限責任公司；MRS肉湯（生物試劑） 杭州百思生物技術有限公司。

UDK159凱氏定氮儀、FIWE6纖維素測定儀、SER 148脂肪測定儀 意大利VELP；X3R高速冷凍離心機 美國Thermo；SW-CJ-1C型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度計 上海市元析儀器有限公司；PTXFA210型電子天平 福州華志科學儀器有限公司；SB-130旋轉蒸發儀 東京理化；JXFSTPRP-24全自動樣品快速研磨機 上海凈信實業發展有限公司；QBS-800汽爆試驗臺 鶴壁正道生物能源有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵飼料的制作 稱取適量的構樹葉粉置于250 mL錐形瓶內在超凈臺上紫外滅菌2 h。按物料:菌液:去離子水一定比例配比混合拌勻，加塞，置于培養箱在合適溫度的環境下培養。菌種發酵構樹葉到一定時間取出置于烘箱60 ℃下烘干，冷卻裝入樣品袋。

1.2.2 單寧標準曲線的繪制 準確稱取單寧酸5 mg，用少量去離子水溶解后移入50 mL容量瓶中定容，配制成0.1 mg/mL的標準液。取6個50 mL容量瓶，先在每個容量瓶中裝約30 mL去離子水，再分別量取單寧標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于容量瓶中，分別加入2.5 mL福林酚試劑、5 mL飽和碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度處，最后超聲使溶液混勻，放置30 min后開始測定吸光度，以未加單寧的混合液做空白，在756 nm處[14]測定吸光值，并以單寧含量（mg）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。得到單寧酸標準曲線的回歸方程：

y=1.946x+0.00589，R2=0.9994。

1.2.3 單寧的提取及含量測定 準確稱取構樹葉飼料樣品1 g（精確到0.0001 g），加入50 mL提取試劑（體積分數為20%的乙醇溶液），置于70 ℃的恒溫水浴鍋中加熱回流40 min，以雙層濾紙過濾，得到的澄清溶液即為單寧溶液。量取1 mL單寧溶液于裝有30 mL去離子水的容量瓶中，按照上述制作標準曲線的順序依次加入2.5 mL福林酚試劑、5 mL飽和碳酸鈉溶液，靜置30 min后，在756 nm處測定吸光度[15]。單寧含量的計算，公式如下：

式中：B：測定到的吸光光度值并在標準曲線上計算處相應50 mL溶液里面的單寧含量，mg；m：樣品質量，g。

1.2.4 不同預處理對構樹葉抗營養因子的影響

1.2.4.1 汽爆條件優化 稱取300 g構樹葉原料，用汽爆試驗臺爆破，在蒸汽壓強1.4 MPa的條件下，考察維壓時間（60、120、180、240、300 s）對構樹葉中單寧含量的影響；在維壓時間120 s的條件下，考察蒸汽壓強（1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 MPa）對構樹葉中單寧含量的影響，每個處理三組重復。

在以上實驗的基礎上，選取蒸汽壓強（1.3、1.4、1.5 MPa）和維壓時間（90、120、150 s），并研究不同條件下對構樹葉中單寧含量的影響，每個處理三組重復，實驗設計見表1。得到構樹葉汽爆粉。

表 1 汽爆條件優化設計Table 1 Optimization design of steam explosion conditions

1.2.4.2 球磨條件研究 稱取1 g構樹葉原料置于研磨儀中，考查球磨時間（5、10、15、20、25 min），研究球磨時間對構樹葉中單寧含量的影響。得到構樹葉球磨粉。

1.2.5 構樹葉發酵工藝條件優化

1.2.5.1 構樹葉發酵菌種配比的優化 稱取5 g構樹葉原料，按1.2.1方法發酵，在30 ℃、含水量40%，發酵3 d的條件下考查菌種配比（酵母菌:芽孢桿菌:乳酸菌分別為1:1:1、2:1:1、3:1:1、1:2:1、2:2:1、3:2:1、1:3:1、2:3:1、3:3:1），研究菌種配比對構樹葉中單寧含量的影響，每個處理三組重復。

1.2.5.2 發酵溫度對單寧含量的影響 稱取5 g構樹葉原料，按1.2.1方法發酵，在發酵3 d、含水量40%的條件下，把構樹葉分別置于24、27、30、33、36、39 ℃的培養箱恒溫發酵，通過測定單寧含量來確定最佳的發酵溫度。

1.2.5.3 發酵時間對單寧含量的影響 稱取5 g構樹葉原料，按1.2.1方法發酵，在33 ℃、含水量40%的條件下，構樹葉分別發酵1、2、3、4、5、6 d，通過測定單寧含量來確定最佳的發酵時間。

1.2.5.4 含水量對單寧含量的影響 稱取5 g構樹葉原料，按1.2.1方法發酵，構樹葉含水量20%、30%、40%、50%、60%、70%，在33 ℃、發酵4 d的條件下，通過測定單寧含量來確定最佳的含水量。

1.2.6 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，選取發酵溫度（A，℃）、發酵時間（B，d）、含水量（C，%），以構樹葉中單寧含量（%）為響應值，根據Box-Behnken中心組合實驗原理，設計三因素三水平響應面分析實驗。其因素水平編碼表見表2。

表 2 Box-Behnken實驗因素水平表及編碼Table 2 Box-Behnken experimental factor level table and coding

1.2.7 不同方式處理發酵參數 原料發酵參數：構樹葉原料，發酵時間4 d，含水量60%，發酵溫度32.50 ℃，釀酒酵母菌:乳酸菌:枯草芽孢桿菌為1:1:1。

球磨發酵參數：構樹葉球磨粉，發酵時間4 d，含水量60%，發酵溫度32.50 ℃，釀酒酵母菌:乳酸菌:枯草芽孢桿菌為1:1:1。

汽爆發酵參數：構樹葉汽爆粉，發酵時間4 d，含水量60%，發酵溫度32.50 ℃，釀酒酵母菌:乳酸菌:枯草芽孢桿菌為1:1:1。

1.2.8 營養成分測定方法 粗蛋白（CP）的測定采用GB/T 6432-2018的方法，粗纖維（CF）的測定采用DB37/T 3370-2018的方法；粗灰分（Ash）的測定采用GB/T 6438-2007的方法；粗脂肪（EE）的測定采用GB/T 6433-2006的方法；鈣（Ca）的測定采用GB/T 6436-2018的方法，磷（P）的測定采用GB/T 6437-2018的方法。

1.2.9 單寧酶活力測定

1.2.9.1 沒食子酸標準曲線的繪制 稱取0.1701 g沒食子酸用去離子水溶解后移入1000 mL容量瓶中定容，配制成0.1 mmol/L溶液，分別吸取0、2、4、6、8、10 mL標準溶液到50 mL容量瓶中定容，配制成6個不同濃度梯度的標準液。分別取0.5 mL沒食子酸標準溶液和0.3 mL甲醇繞丹寧溶液（0.05 mol/L)，加到所有試管中，在30 ℃反應5 min。將0.2 mL（0.5 mol/L）的KOH水溶液加入到所有的試管后，再次在30 ℃水浴5 min，最后在所有試管中加入4 mL蒸餾水稀釋,以蒸餾水作空白，在520 nm波長下測定吸光值，得到沒食子酸溶液標準曲線。并以沒食子酸濃度（μmol/L）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。得到沒食子酸標準曲線的回歸方程：

y=0.003x?0.0023，R2=0.9988。

1.2.9.2 單寧酶活力測定 此方法是根據沒食子酸（單寧酶催化沒食子酸丙酯水解產生沒食子酸）與甲醇羅丹寧在堿性條件下之間形成色團物質的方法來測定單寧酶的活性，將30 ℃條件下每分鐘產生1 μmol沒食子酸所需的酶量定義為一個酶活單位（1 U）。取三支潔凈的試管分別標記為空白管、測試管、對照管。將底物沒食子酸丙酯（0.01 mol/L）以及粗酶液在反應開始之前先放入30 ℃水浴中預熱10 min。在被標記的三支試管中都加入0.25 mL沒食子酸丙酯溶液，接著取0.25 mL檸檬酸緩沖液（pH=5，0.1 mol/L）加入空白管中，0.25 mL粗酶液加入到測試管中后將三支試管都放入30 ℃水浴10 min，然后將0.3 mL甲醇羅丹寧溶液（0.05 mol/L）加入所有試管中，30 ℃水浴10 min，之后取0.2 mL的KOH（0.5 mol/L）溶液加入所有試管中，30 ℃水浴10 min，然后僅在對照管的反應混合物中加入0.25 mL粗酶液，搖勻充分混合。最后每支試管都加入4 mL去離子水，在30 ℃下保溫10 min后，在520 nm波長下測定反應混合物的吸光值，以去離子水為參比溶液。所有測試都做3個平行實驗，取算術平均值。根據沒食子酸標準曲線換算酶活力。

1.2.10 微生物多樣性 參照GB 4789.35-2016對飼料中的乳酸菌進行菌落計數，參照GB/T 26428-2010對飼料中的枯草芽孢桿菌進行菌落計數，參照GB 4789.15-2016對飼料中的酵母菌進行菌落計數。

1.3 數據處理

采用Origin2017和SPSS22.0進行數據整理并進行統計分析，測定數據用“平均值±標準差”表示，各項測定均三次重復。

2 結果與分析

2.1 汽爆條件優化

2.1.1 維壓時間對單寧含量的影響 由圖1可知，在汽爆壓強1.6 MPa的條件下，隨著維壓時間的延長，單寧含量呈現先下降再升高的趨勢。維壓120 s時具有顯著性差異（P<0.05）。原因是由于水蒸氣與構樹葉接觸的時間延長，讓一部分單寧發生了聚合或縮合反應，同時將構樹葉中未被檢測出的單寧釋放出來。當維壓時間在120 s對構樹葉中得到單寧含量最低，此時構樹葉中的單寧含量為2.19%，因此選擇維壓時間120 s進一步優化汽爆條件。

圖 1 維壓時間對構樹葉中單寧含量的影響Fig.1 Effect of pressure maintaining time on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

圖 2 汽爆壓強對構樹葉中單寧含量的影響Fig.2 Effect of steam explosion pressure on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.1.2 汽爆壓強對單寧含量的影響 由圖2可知，在維壓時間120 s的條件下，構樹葉中單寧含量隨著汽爆壓強的增加先增加后降低最后又呈增加趨勢。汽爆壓強為1.4 MPa時含量最低，單寧含量為1.68%。剛開始單寧含量升高的原因是構樹葉中未被檢測到的單寧釋放出來，隨著壓強的增加，蒸汽不斷擠壓構樹葉結塊，導致蒸汽無法進去結塊內部，使單寧無法被降解[16]。汽爆壓強在1.4 MPa時最有利分解單寧。因此選擇汽爆壓強1.4 MPa、維壓時間120 s進一步優化。

2.1.3 汽爆條件的優化與選擇 由圖3可知，汽爆壓強1.3 MPa時，構樹葉中單寧含量隨著維壓時間的增加而減少。汽爆壓強在1.4、1.5 MPa時，單寧含量隨著維壓時間的增加而增加。相同維壓時間，單寧含量隨著汽爆壓強的增加先減小后增加。驗證了汽爆壓強和維壓時間對構樹葉中單寧含量具有一定的影響，單寧含量減低是因為汽爆會降解單寧。升高是因為蒸汽不斷擠壓構樹葉結塊，導致蒸汽無法就如結塊內部。氣爆壓強1.4 MPa、維壓時間90 s時構樹葉中的單寧含量最低，有顯著性差異（P<0.05）。因此，以單寧含量為指標，汽爆的最佳條件選擇汽爆壓強1.4 MPa、維壓時間90 s。

圖 3 汽爆條件對構樹葉單寧含量的影響Fig.3 Effect of steam explosion conditions on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.2 球磨對單寧含量的影響

由圖4可知，構樹葉中單寧含量先隨著球磨時間的延長而增加，到了10 min之后，單寧含量呈下降趨勢，20 min之后單寧含量呈上升趨勢。球磨20 min時，構樹葉中單寧含量最低，單寧含量為1.7%，降單寧效果具有顯著性差異（P<0.05）。單寧含量降低的原因是，球磨過程中產生大量熱量導致單寧降解。因此，以單寧含量為指標，球磨構樹葉的球磨時間宜選擇20 min。

圖 4 球磨時間對構樹葉中單寧含量的影響Fig.4 Effect of ball milling time on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.3 發酵構樹葉菌種配比的選擇

從圖5可知，酵母菌:芽孢桿菌:乳酸菌=1:1:1時發酵構樹葉，單寧含量最低，此時含量為1.81%，降單寧效果有顯著性差異（P<0.05）。混菌發酵時，菌種會有協同作用，也會抑制其他菌的生長，從實驗結果，選擇酵母菌:芽孢桿菌:乳酸菌=1:1:1時發酵構樹葉。

圖 5 菌種配比對發酵構樹葉單寧含量的影響Fig.5 Effect of strain ratio on tannin content in fermented Broussonetia papyrifera leaves

2.4 單因素實驗結果

2.4.1 發酵溫度對單寧含量的影響 由圖6可知，發酵溫度在24~33 ℃，單寧含量呈下降趨勢；超過33 ℃，單寧含量呈上升趨勢，因此可以確定33 ℃是構樹葉發酵生產蛋白飼料的最佳溫度，此時單寧含量1.31%。一部分原因是因為隨著溫度對菌種活性的影響，酵母菌產生胞外單寧酶對單寧進行一定的降解，當溫度超過33 ℃時，菌種的活性變弱，對單寧的降解也變弱，導致溫度升高，單寧的含量反而呈上升趨勢；另一個原因是單寧屬于多酚，多酚隨著溫度升高會發生自縮合或聚合，含量降低[17]。因此，確定最近的發酵溫度是33 ℃。

圖 6 發酵溫度對構樹葉中單寧含量的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.4.2 發酵時間對單寧含量的影響 由圖7可知，發酵第1~2 d時，構樹葉單寧含量呈降低趨勢，第3 d單寧含量增加，到第4 d時降單寧效果最佳，此時單寧含量為1.53%，之后又開始呈升高趨勢。可能原因是，隨著發酵時間的增加，菌的活性變強，單寧酶增加導致單寧分解。隨著發酵的進行，微生物把許多大分子降解為小分子，其中含有酚類物質，這就導致了單寧含量又開始上升。構樹葉中的單寧縮合物在發酵開始時處于不溶于水的狀態而未被檢測出來，但隨著發酵的進行，縮合物水解出來進而轉化成了單寧[18]。由于微生物在固態發酵的封閉環境中，氧氣被逐漸消耗，微生物的呼吸方式變成無氧呼吸，微生物體內的新陳代謝途徑發生變化，導致新生成的單寧未被立即分解[19]。因此，確定最佳的發酵時間是4 d。

圖 7 發酵時間對構樹葉中單寧含量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.4.3 含水量對單寧含量的影響 由圖8可知，隨著含水量增加，構樹葉單寧含量呈降低趨勢，此時單寧含量為1.50%，含水量60%時降單寧具有顯著性差異（P<0.05），之后又開始呈升高趨勢。可能原因是由于高水分增加了固體構樹葉中的物料膨脹，微生物能更充分地與物料接觸獲得營養物質和足夠的氧氣，更好地生長[20]。含水量對發酵飼料pH變化有顯著影響，但含水量過高或過低不利于pH的降低[21]。因此，確定最佳的含水量是60%。

圖 8 含水量對構樹葉中單寧含量的影響Fig.8 Effect of water content on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.5 響應面試驗結果

2.5.1 響應面試驗結果及回歸方程擬合 利用Design-Expert V8.0.6軟件，對實驗結果進行多項式回歸方程分析，結果見表3。對實驗數據回歸擬合，得到自變量與單寧含量的二次回歸方程方程式為：Y=1.35+0.12C?0.075AC+0.48A2+0.63B2+0.38C2。

表 3 響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.5.2 響應面模型方差及顯著性分析 對回歸方程進行方差分析結果如表4。由表4可知，該回歸模型高度顯著（P<0.001），失擬項F值為1.06，P為0.4584（P>0.05），失擬項不顯著，表明擬合度良好，能較好解釋響應面中的變異。模型決定系數R2=0.9876，校準決定系數R2Adj=0.9716，說明該擬合度良好，能用該模型分析和預測發酵構樹葉制備工藝過程中各參數的變化。模型回歸系數顯著性分析顯示，一次項C極顯著（P<0.01），二次項A2、B2、C2對降抗營養因子的影響均為高度顯著（P<0.001）。各因素顯著性程度依次為發酵溫度>含水量>發酵時間。

表 4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.5.3 交互作用分析結果 由圖9可知，單寧含量隨著發酵時間的延長，含水量增加以及發酵溫度的升高均呈現先減小后增加的趨勢，說明兩兩因素交互中均存在極小值且極值對應的點接近橢圓的中心。同時觀察到響應面斜率隨發酵溫度的變化而變化較大，說明發酵溫度對構樹葉中單寧含量的影響大于發酵時間和含水量，與上述方差分析結果相一致。

圖 9 各因素交互作用對構樹葉中單寧含量的影響Fig.9 Effect of interaction of various factors on tannin content in Broussonetia papyrifera leaves

2.5.4 模型驗證結果 經過響應面優化最佳發酵工藝為：發酵時間4 d，含水量60%，發酵溫度32.50 ℃，預測該條件下構樹葉單寧含量為1.34%。根據所擬合的最佳條件進行驗證試驗，平行三次，取平均值得到構樹葉單寧含量為1.42%，誤差值為0.03%，與預測值接近，證明了該方程的可行度和準確性。

2.6 常規營養成分分析

由表5可知，原料的粗蛋白含量為16.83%，經過發酵構樹葉中粗蛋白含量為20.80%，差異性顯著（P<0.05），粗蛋白含量提高了23.59%，經汽爆后發酵和球磨后發酵的粗蛋白分別提高了10.28%和7.84%；原料的粗纖維含量為15.66%，經過發酵粗纖維含量降低了15.33%（P<0.05），經汽爆后發酵和球磨后發酵的粗纖維分別降低了12.32%和7.85%；原料的鈣含量為2.70%，經發酵后鈣含量無明顯變化，經汽爆發酵后和球磨后發酵分別增加了23.33%和22.22%（P<0.05）。預處理和發酵對磷、粗灰分和粗脂肪的含量幾乎無影響，磷含量在0.3%左右，粗脂肪含量在2.4%左右。

表 5 常規營養成分表（%，干基）Table 5 Table of conventional nutrients (%, dry basis)

2.7 發酵過程中的酶活力

由圖10可知，從發酵開始到發酵第3 d，酶活力不斷增加，且在第3 d酶活力最高，球磨發酵、汽爆發酵和原料發酵的酶活力分別達到了65.10、44.77和41.43 U。到了第4 d，酶活力開始下降。在第3 d的時間，按酶活力大小進行排序：球磨發酵>汽爆發酵>原料發酵。與2.6中降單寧的結果一致，說明單寧酶活力越大，降單寧效果越好，符合實驗的規律。

圖 10 構樹葉發酵過程中的酶活力Fig.10 Enzyme activity of Broussonetia papyrifera leaves during fermentation

2.8 發酵過程中微生物多樣性

構樹葉發酵過程中的益生菌計數結果見表6。酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌的總菌數呈現先增加后減少的趨勢，發酵到第3 d的時候，菌落總數最多。原料發酵的酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌分別為6.0×107、1.1×108和3.0×106CFU·g?1。球磨發酵的酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌分別為2.25×107、1.1×108和5.5×106CFU·g?1。汽爆發酵的酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌分別為2.0×107、9.0×107和2.5×106CFU·g?1。

表 6 構樹葉發酵過程中的益生菌計數結果Table 6 Probiotic counting results during fermentation of Broussonetia papyrifera leaves

3 結論與討論

本實驗采用蒸汽爆破、球磨等方式對構樹葉進行預處理，以抗營養因子單寧含量為考察指標，通過響應面分析法確定枯草芽孢桿菌、乳酸菌和釀酒酵母菌的復合菌固態發酵構樹葉制備蛋白飼料的最佳工藝。最佳工藝條件為：汽爆壓強1.4 MPa，維壓時間90 s；球磨時間20 min；發酵時間4 d，含水量60%，發酵溫度32.50 ℃，釀酒酵母菌:乳酸菌:枯草芽孢桿菌=1:1:1。構樹葉經發酵、汽爆后發酵和球磨后發酵單寧含量分別降低了36.2%、39.5%和60.5%；粗蛋白含量分別增加了23.59%、10.28%和7.84%。原料發酵、汽爆發酵和球磨發酵的酶活力分別高達41.43、44.77和65.10 U。

本實驗通過球磨和汽爆處理構樹葉發酵的蛋白質增加率低于未處理是因為微生物的生命活動過程中會消耗營養物質，球磨和汽爆處理可以加快發酵時間，其發酵條件還可以進一步優化。發酵構樹葉提高了蛋白質含量，降低了單寧含量，大大提高了構樹葉的利用度，可以緩解目前畜禽飼料短缺的問題。

構樹葉蛋白質結構復雜和抗營養因子單寧的存在，導致動物難以消化和吸收利用，這降低了飼料的營養價值。通過微生物的發酵，降解構樹葉中復雜蛋白質為動物可消化的氨基酸、小肽等易被動物消化利用的形式并降解掉其中的粗纖維，構樹葉完全可以成為應用廣發的綠色飼料資源[22]。通過發酵，微生物降解單寧，實質上是微生物分泌的單寧酶作用于單寧分子中的醋鍵，使之降解成倍酸（或靴花酸）和葡萄糖，而且微生物還可繼續分泌其他酶（如多酚氧化酶等），進一步將其降解為芳香族脂肪酸等小分子物質[3]。管維等[23]等通過微生物發酵，菜籽餅的單寧降解率14.75%，葉添梅等[24]等通過混菌發酵處理，桑葉的單寧降解率46.35%。本實驗將構樹葉直接發酵，單寧降解率為36.2%，通過球磨處理后發酵，單寧降解率為60.5%，大大提高了降解率。Jazi等[25]通過發酵處理，發酵7 d后棉粕中粗蛋白含量增加了7.92%。李海新[22]用米酒曲酶發酵構樹葉，粗蛋白含量增加了5.29%。本實驗中經發酵構樹葉中粗蛋白含量為20.80%，差異性顯著（P<0.05），粗蛋白含量提高了23.59%，汽爆后發酵和球磨后發酵粗蛋白含量分別增加了10.28%和7.84%，本實驗大大提高了粗蛋白的增加量。