酶法輔助熱水浸提刺梨多糖工藝優化及其抗腫瘤活性研究

唐健波，呂 都，彭 梅，范建新，潘 牧，陳朝軍，王 輝，楊 娟,

（1.貴州省農科院食品加工研究所，貴州貴陽 550025；2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550014；3.貴州醫科大學藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州貴陽 550014；4.貴州省農科院亞熱帶作物研究所，貴州貴陽 550025）

刺梨（Rosa roxbunghiiTratt，RRT），為薔薇科薔薇屬落葉灌木植物，主要分布于我國西南省份海拔1000~1600 m的山區[1]。2019年初，刺梨被貴州省列為12個農業特色優勢產業之一，并得到快速發展，種植面積和加工能力逐年上升。據統計，至2020年底，貴州省刺梨種植面積突破200萬畝，全省刺梨鮮果產量超10萬噸，同比增長51%，全省35家刺梨重點加工企業年鮮果加工能力達14萬噸，刺梨產業在貴州省呈現出蓬勃生機。

現代研究表明，刺梨富含多種營養元素和功能成分，包括多糖、多酚、維生素C、超氧化物歧化酶、黃酮、維生素B以及多種礦物質元素[2?6]，具有抗氧化[2,7]、抗腫瘤[8]、抗炎[9]、防輻射[9?10]、抗動脈粥樣硬化[11]、促進胃腸道消化[12]等多種藥用功效，在功能性食品及藥品的開發上均具有廣闊的應用前景。

天然植物多糖由于具有抗氧化、抗腫瘤、乳化、增稠、起泡、膠凝等多種特性，且相較于人工合成藥物或添加劑，具有作用效果好、毒副作用小和安全系數高等優點，一直以來都是研究的熱點[13?14]。其中，刺梨多糖（Rosa roxbunghiiTratt polysaccharide，RRTP）作為刺梨中的主要功能性成分，對刺梨產品的開發和研究均具有重要影響。因此，對刺梨多糖的提取方法及其功能特性進行系統研究將具有重要理論和現實意義。

本研究考慮到傳統溶劑或熱水提取刺梨多糖需要大量的化學溶劑，萃取時間長，提取效率低、加工溫度高，會對刺梨多糖的生物活性和安全性產生不利影響，擬從追求綠色提取工藝的角度出發，建立一種新的酶法輔助熱水浸提刺梨多糖工藝并對其抗腫瘤活性進行評價，獲得一種提高刺梨多糖的提取效率和生物活性的綠色提取工藝，以期為刺梨多糖的進一步開發和綜合應用奠定良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨干果 貴州省貴陽市萬東橋藥材市場；昆明種小鼠（雌雄各半，共60只，體重20±2 g） 由貴州醫科大學試驗動物中心提供；S180瘤株 由貴州大學楊再昌教授惠贈并由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室妥善傳代并保存；無水乙醇、濃硫酸

重慶川東化工有限公司；纖維素酶（≥15000 U/g）、苯酚、冰醋酸、亞甲藍、羧甲基纖維素鈉、生理鹽水

國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖 天津市致遠化學試劑有限公司；環磷酰胺 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

DK-98-11型水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；MD spectra MAX-190型連續波長酶標儀 美國MD公司；HP-8435型紫外可見分光光度計 美國惠普公司；AL204型梅特勒電子分析天平 梅特勒·托利多儀器（上海）有限公司；DZF-6021型真空干燥箱

上海精宏實驗設備有限公司；FW型高速萬能粉碎

天津泰斯特儀器有限公司；PH100生物顯微鏡鳳凰光學集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺梨多糖提取工藝優化

1.2.1.1 刺梨干果預處理 采用60 ℃真空干燥刺梨干果至恒重，高速萬能粉碎機粉碎（1 min），過40目篩，用80%乙醇加熱回流提取8次，初步除去生物堿、甙類等醇溶性物質（每次2 h），抽濾得刺梨粉末，于60 ℃真空干燥至恒重后制得預處理樣品。

1.2.1.2 刺梨多糖酶法輔助熱水浸提工藝 取預處理樣品5 g，加入500 mL圓底燒瓶中，按照設定液料比添加0.1 mol/L的提前配制的固定pH檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，并按設定酶添加濃度添加纖維素酶，混勻后放入水浴鍋中，在設置的提取溫度和提取時間條件下進行酶解，酶解反應結束后，將溫度提升至90 ℃進行滅酶并浸提3 h，抽濾后得濾液。濾液進行減壓濃縮后，置于截留分子量>14000 Da的透析袋中，以流動蒸餾水進行透析除去小分子雜質后，減壓濃縮至一定體積，并根據體積計算加入適量無水乙醇，使樣品中乙醇濃度達到80%，樣品攪拌均勻后，置于4 ℃冰箱中靜置12 h。將樣品取出，抽濾并用無水乙醇洗滌析出絮凝物2~3次，將絮凝物在60 ℃真空干燥至恒重后得刺梨粗多糖。

1.2.1.3 刺梨多糖酶法輔助熱水浸提單因素實驗本研究選用酶解pH、酶解時間、酶解溫度以及酶添加濃度四個影響因素，考察影響因素對酶法輔助熱水浸提刺梨多糖得率的影響。固定液料比30:1 mL/g，酶解pH5.8，酶解時間4 h，酶解溫度50 ℃，酶添加濃度1.5%，提取1次的基本條件，分別改變酶解pH（4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2）、酶解時間（1、2、3、4、5、6、7 h）、酶解溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、酶添加濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）四個因素的條件，考察其對酶法輔助熱水浸提刺梨多糖得率的影響。

1.2.1.4 刺梨多糖酶法輔助熱水浸提響應面優化試驗 根據單因素實驗結果，結合Box-Benhnken中心組合試驗（BBD）設計原理，在液料比30 mL/g，提取1次的原則下，選取酶解pH、酶解時間、酶解溫度和酶添加濃度作為自變量，刺梨多糖得率為響應值，利用軟件Design-Expert.V8.0.6進行試驗設計及結果分析。試驗因素及水平如表1所示。

表 1 響應面試驗因素及水平設計Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.1.5 刺梨多糖含量測定和多糖得率的計算 參考唐健波等[15]的方法，采用苯酚-硫酸法進行刺梨多糖含量測定。以蒸餾水為空白對照，以葡萄糖為標準品，吸光度為橫坐標，葡萄糖質量為縱坐標，制作標準曲線Y=0.0057X+0.0202，R2=0.9981。根據多糖含量計算刺梨多糖得率。

式中：m為刺梨粗多糖的質量（g）；ω為粗多糖中多糖的含量（%）；M為預處理樣品的質量（g）。

1.2.2 刺梨多糖抗腫瘤試驗

1.2.2.1 S180實體瘤模型的建立 參考Zong等[16]的方法并適當進行修改。將保存于液氮罐中的S180瘤株進行復蘇，用醫用酒精對小鼠腹部進行消毒后，取0.2 mL復蘇的腫瘤液接種于小鼠腹腔中，然后讓接種后的小鼠在標準動物試驗室（溫度為23±2 ℃，濕度為55%±5%，白天黑夜各為12 h）中進行自由飲水和進食。接種7 d后，用無菌注射器從小鼠腹腔抽取腫瘤液，按照以上方法進行第二次傳代，經臺盼藍染色計數，活細胞數目>95%時，方可進行下步腫瘤接種。采用無菌注射器抽取第二次傳代小鼠腹腔中的腫瘤液，用生理鹽水稀釋3倍制成細胞懸液，將細胞懸液按每只小鼠0.2 mL的劑量皮下接種于小鼠右腋下。整個實驗過程中，如果出現空白組小鼠腫瘤平均瘤重<1 g、20%小鼠瘤重<0.49 g或小鼠死亡數>20%中的任意情況，則判定試驗失敗。

1.2.2.2 動物分組及實驗過程 參考并部分修改Cai等[17]的方法。將昆明種小鼠在標準動物試驗室進行適應性飼養2 d，挑選生長狀態良好的健康小鼠60只，雌雄各半，按照1.2.2.1中的方法進行腫瘤接種，建立S180實體瘤模型。小鼠接種24 h后，將小鼠隨機分為5組（n=12）：空白對照組（CT），環磷酰胺組（CTX），多糖高劑量組（H-PS）、中劑量組（M-PS）、低劑量組（L-PS），每組小鼠12只，雌雄各半。用生理鹽水配制3.5 mg/mL的環磷酰胺溶液（現配現用）作為CTX組藥劑，用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制不同劑量的多糖藥劑，以0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液作為空白組藥劑。其中：CT組，灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉0.1 mL/10 g，1 d 1次；CTX組，根據前期實驗基礎，選擇腹腔注射環磷酰胺溶液0.1 mL/kg（即劑量為35 mg/kg），第1次注射后，間隔3 d注射一次，一共注射3次；H-PS組，灌胃刺梨多糖400 mg/kg，1 d 1次；M-PS組，灌胃刺梨多糖200 mg/kg，1 d 1次；L-PS組，灌胃刺梨多糖100 mg/kg，1 d 1次。連續10 d。

1.2.2.3 抑瘤率的計算 參考賈福懷等[18]的方法，在最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h，將小鼠以脊椎脫臼法處死，剝離出小鼠右腋下腫瘤，稱重，計算抑瘤率。

式中：m為給藥組平均腫瘤質量（g），M為空白組平均腫瘤質量（g）。

1.2.2.4 外周血白細胞計數 參考姚佳等[19]的方法。在最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h后，用毛細管（0.9 mm×100 mm）進行眼眶取血，然后進行外周血白細胞計數。具體方法為：在試管中加入白細胞稀釋液（冰醋酸2 mL、蒸餾水98 mL、10 g/mL的亞甲藍溶液3~5滴）0.38 mL，然后加入小鼠眼眶新鮮血液20 μL，將試管輕微震蕩2 min混勻后立即吸取10 μL懸液充入血球計數板計數池內，靜置2~3 min后在顯微鏡低倍鏡下對四角的4個大方格內白細胞總數計數，并計算白細胞總數。

1.2.2.5 胸腺指數和脾臟指數的測定 參考姚佳等[19]的方法。在最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h后，小鼠稱重后以脊椎脫臼法處死，分別去除小鼠的胸腺和脾臟，擦干周邊血跡后進行稱重，并按下列公式計算胸腺指數和脾臟指數。

1.3 數據處理

用SPSS 20.0進行單因素方差分析和多重比較（P<0.05為顯著差異），數據以平均值±標準偏差表示（±s）；采用Design-Expert V 8.0.6進行響應面設計及參數優化和統計分析；采用OriginPro 2018對試驗數據進行繪圖，圖或表中的小寫字母表示差異顯著（P<0.05）；所有工藝優化試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 酶法輔助熱水浸提刺梨多糖單因素實驗結果

2.1.1 酶解pH對刺梨多糖得率的影響 如圖1所示，隨著酶解pH的升高，刺梨多糖得率呈現明顯的上升趨勢，當pH達到5.4時，多糖得率上升趨勢明顯變緩。其中pH在5.4和5.8時，多糖得率不存在顯著差異（P>0.05）；pH在5.8和6.2之間時，同樣不存在顯著差異（P>0.05）。這可能是因為以刺梨預處理樣品作為反應底物時，纖維素酶在pH5.8附近時呈現出較好的酶解反應活性，促進了刺梨多糖的溶出。同時考慮到，pH是通過酶活性中心上必需基團的解離水平調節影響酶分子對底物的結合及催化，酶反應速度直接受到適宜pH的調控，且酶的空間結構在不同的pH下會發生變化，從而改變酶的構象和活性，影響到刺梨多糖的得率，這與高濤等[20]的研究結果基本一致。因此，綜合考慮，選擇酶解pH5.4、5.8、6.2這三個水平進行響應面試驗。

圖 1 酶解pH對刺梨多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the yield of RRTP

圖 2 酶解時間對刺梨多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of RRTP

2.1.2 酶解時間對刺梨多糖得率的影響 由圖2所示，隨著酶解時間的增加，刺梨多糖得率呈現先上升后下降的拋物線形式呈現。在1~4 h內，隨著酶解時間的延長，刺梨多糖得率顯著性升高（P<0.05），在酶解時間達到4 h時，刺梨多糖得率達到最高點。之后，隨著酶解時間的繼續延長，刺梨多糖得率開始顯著性降低（P<0.05），這可能是由于隨著酶解時間的延長，刺梨多糖受酶作用的影響發生部分水解從而導致得率降低，這與Guo等[21]的研究結果一致。因此，綜合考慮后選擇采用酶解時間為3、4、5 h三個水平進行響應面試驗。

2.1.3 酶解溫度對刺梨多糖得率的影響 由圖3所示，隨著酶解溫度的上升，刺梨多糖得率先逐步上升，當溫度達到40 ℃時，刺梨多糖得率達到最高點，然后隨著溫度的繼續上升（40~70 ℃），多糖得率呈顯著性降低（P<0.05）。這一研究結果與呂長鑫[22]等一致，這說明試驗所選用的纖維素酶在40 ℃左右時具有最佳的作用溫度，此時酶的活性最大，有利于酶解反應的進行。當溫度過高時，纖維素酶中心位點因為受熱失去原有的活性而導致催化能力下降；溫度過低時，酶活性同樣也會因為受到抑制而很難發揮較好的水解作用。其中，當溫度由70 ℃上升到80 ℃時，刺梨多糖得率有一個顯著性的提高過程，這可能是由于80 ℃是熱水浸提工藝中較適宜的一個浸提溫度的原因，這也與我們前期的試驗結果吻合。因此，在接下來的響應面試驗中，選擇酶解溫度30、40、50 ℃三個水平進行試驗。

圖 3 酶解溫度對刺梨多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of RRTP

圖 4 酶添加濃度對刺梨多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the yield of RRTP

2.1.4 酶添加濃度對刺梨多糖得率的影響 由圖4所示。隨著酶用量的增加，刺梨多糖得率先顯著提高（P<0.05），后略有下降，在酶添加濃度為1.5%時，刺梨多糖得率達到最高5.84%。這可能是因為隨著纖維素酶用量的增加，酶接觸底物的機會相應地增加，酶對細胞壁的水解作用促進了多糖的溶出，從而提高多糖的產量，這與Hu等[23]的研究一致。當酶用量足夠與底物進行反應時，進一步增加酶用量不僅不能提高多糖得率，反而過量的酶會在造成提取成本升高的同時可能造成多糖的部分水解，進而導致刺梨多糖得率降低。因此，在接下來的響應面試驗中，選擇酶添加濃度1.0%、1.5%、2.0%三個水平進行試驗。

2.2 酶法輔助熱水浸提刺梨多糖響應面優化試驗結果

2.2.1 刺梨多糖得率預測模型及方差分析 根據前面的單因素實驗結果，按照表1中的設計因素和水平，利用Design-Expert V8.0.6軟件，根據BBD試驗設計四因素三水平的響應面試驗。BBD試驗的變量值與相應的刺梨多糖得率試驗結果見表2。經回歸擬合，四個提取變量（A、B、C、D）與刺梨多糖得率的關系可表示為如下的二次多項式方程：

表 2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Benhnken experiment

Y=6.10+0.31A?0.061B+8.333E?004C+0.027D+0.043AB+0.080AC+0.098AD?0.16BC+0.045BD?0.047CD?0.055A2?0.33B2?0.40C2?0.24D2

表3 為對上述方程進行方差分析的結果。

由表3的分析結果可知，模型具有較大的F值（F=45.32），同時具有非常低的P值（P<0.0001），說明該預測模型差異極顯著，以上二次多項式方程與實際情況擬合很好，能夠較好的反應刺梨多糖得率與所選實驗因素之間的相互關系。失擬項的F=1.25，P=0.4479>0.05，差異不顯著，說明模型與所選試驗因素之間具有很好的擬合度。同時，模型決定系數R2=0.9784，變異系數C.V.=1.22%，精密度=21.988>4，表明此模型能夠預測97.84%的刺梨多糖得率的變化，僅存在1.22%的變異，模型精密度高，試驗結果可靠性較好，可以用此模型來分析和預測酶法輔助熱水浸提刺梨多糖的提取工藝。模型結果顯示，試驗因素酶解pH對刺梨多糖得率影響極其顯著（P<0.001），酶解時間高度顯著（P<0.01），影響酶法輔助熱水浸提刺梨多糖得率的因素大小順序為：酶解pH（A）>酶解時間（B）>酶添加濃度（D）>酶解溫度（C）。交互項AC、AD對刺梨多糖得率影響均顯著（P<0.05），BC高度顯著（P<0.01），二次項B2、C2、D2極其顯著（P<0.001），表明各影響因素之間存在著明顯的共同作用，影響著刺梨多糖的最終得率。

表 3 響應面模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.2.2 響應面曲面及因素交互作用分析 如圖5所示，三維響應面圖可以非常直觀的反映酶解pH、酶解時間、酶解溫度和酶添加濃度等影響因素及其相互作用對于響應值刺梨多糖得率的影響，即當其中兩個影響因素在試驗范圍內逐步變化時，將另外兩個因素固定在中心點，刺梨多糖得率將隨著這兩個影響因素的變化而變化將直觀地展示在三維立體圖中。從圖5中三維立體圖可以看出，圖5b、圖5c、圖5f的三維曲面圖相對于其他幾個圖更為陡峭，且圖中的等高線形狀為橢圓形，表明圖形對應的兩組影響因子交互作用更為明顯，其對刺梨多糖得率的影響更顯著，而圖5a、圖5d、圖5f投影的等高線形狀為圓形，說明圖中對應的兩組影響因子交互作用不顯著，這一結果與表3中的方差分析結果一致。

圖 5 不同因素交互作用對刺梨多糖得率影響的三維響應面圖Fig.5 3D-response surface plots of the interaction of different variables on the yield of RRTP

2.2.3 回歸模型優化 根據回歸模型計算，在酶解pH6.2，酶解時間3.97 h，酶解溫度40.93 ℃，酶添加濃度1.62%，酶解反應完成后90 ℃熱水浸提3 h的工藝條件下，預測刺梨多糖得率為6.37%。為驗證預測模型可信度，同時考慮便于實際操作的需要，將提取工藝參數設置為：酶解pH6.2，酶解時間4 h，酶解溫度41 ℃，酶添加濃度1.62%。經信度符合性檢驗，驗證試驗中刺梨多糖得率為6.32%±0.12%（n=3），與模型預測的刺梨多糖得率契合度為99.22%，這一結果中，刺梨多糖得率幾乎達到超聲提取[15]的3倍。因此，確定該回歸模型可用于預測刺梨多糖的提取，同時該提取方法對刺梨多糖的提取具有提取效率高、環保綠色等優點。

2.3 刺梨多糖抗腫瘤試驗結果

由表4的試驗結果可知，酶法輔助熱水浸提的刺梨多糖在一定劑量下具有較好的抗腫瘤效果，當采用中等劑量治療時，對腫瘤小鼠的抑瘤效果最好。其中，刺梨多糖試驗組與CTX組相比，白細胞、胸腺指數和脾臟指數顯著升高（P<0.01），表現出更優的腫瘤小鼠免疫能力提升作用。前人研究表明，CTX是在臨床上廣泛應用的廣譜抗腫瘤藥物，可對腫瘤產生細胞毒素作用，對抑制腫瘤生長具有較好的效果[24]。然而，CTX在應用過程中同時也存在著諸多毒副作用，如導致白細胞減少[25]，肝功能障礙[26]以及尿血或排尿困難[27]等。從CTX組與CT組的對比數據可知，CTX組的白細胞數量顯著減少（P<0.01），胸腺指數（P<0.05）和脾臟指數（P<0.01）也顯著下降，這一結果與前人的研究基本一致。從抑制腫瘤的效果來看，MPS組的抑瘤率達52.13%，達到了CTX組的83.65%，同時M-PS組的白細胞數相對于CT顯著升高（P<0.01），而胸腺指數和脾臟指數基本接近，分析原因可能是M-PS組在提升腫瘤小鼠免疫能力的同時，對胸腺和脾臟等免疫器官的毒副作用相對較小，而L-PS組的藥力效果相對較小，從而最終造成M-PS組的抑瘤率大于H-PS組和L-PS組。

表 4 刺梨多糖對荷S180小鼠抑瘤作用、外周血白細胞及其臟器的影響Table 4 Effect of PPRT on tumor inhibition, peripheral blood leucocyte and viscera index on S180 tumor-bearing mice

3 結論

本文采用響應面法對酶法輔助熱水浸提刺梨多糖提取工藝進行研究，得到最優工藝參數：酶解pH6.2，酶解時間4 h，酶解溫度41 ℃，酶添加濃度1.62%，液料比30:1 mL/g，酶解反應完成后90 ℃熱水浸提3 h。此工藝條件下，預測刺梨多糖得率為6.37%。經實驗驗證刺梨多糖得率為6.32%±0.12%，與模型預測得率契合度為99.22%，結果表明回歸模型準確可靠。抗腫瘤活性研究表明，在灌胃劑量為200 mg/kg時，酶法輔助熱水浸提刺梨多糖對S180腫瘤小鼠的抑瘤率為52.13%±1.84%，具有明顯的抗腫瘤活性和一定提升腫瘤小鼠免疫能力的作用，具有作為功能性食品添加或天然抗腫瘤藥物來源的潛力。同時，該工藝尚存在著后期處理過程中浸提時間過長的問題，以微波或超聲輔助提取來改進提取工藝將是未來的研究方向，但也應關注工藝的變化對多糖活性造成的影響。