不同凍藏時間的豬肉品質(zhì)比較及其變化機(jī)制研究

馬志強(qiáng)，鐘 艷，魏雪林，王力均，黃玉坤，陳祥貴，楊 瀟

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610039）

我國是世界上最大豬肉消費(fèi)國，為保障豬肉的正常銷售、流通及市場穩(wěn)定，對其進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁A藏十分必要，在眾多貯藏方式中，冷凍貯藏是目前應(yīng)用最廣泛的貯藏手段。我國在20世紀(jì)80年代就設(shè)置了中央儲備肉，在《中央儲備肉管理辦法》中規(guī)定，冷凍豬肉需要每年輪換3輪，每次儲備4個月左右，而在國家標(biāo)準(zhǔn)“GB/T 20575-2019鮮、凍肉生產(chǎn)良好操作規(guī)范”中對豬肉的貯藏溫度、濕度、堆放等也做了明確的規(guī)定。但其中并沒有對凍藏豬肉的貯藏時間做出明確的規(guī)范，也未給出合適的時間指導(dǎo)，對于凍藏豬肉的食品安全存在隱患。

而對于豬肉在冷凍儲藏過程中的變化，在國內(nèi)外都進(jìn)行了廣泛的研究。在李芳菲等[1]的研究中指出凍藏時間（12個月）越長越容易引起肌原纖維蛋白等分子降解；而黃鴻兵等[2]的研究結(jié)果也證明凍藏溫度和時間（150 d）會對豬肉中冰晶、揮發(fā)性鹽基氮含量和硫代巴比妥酸還原值造成顯著影響；Gil等[3]的研究指出短時間（2個月）的凍藏不會對野豬肉品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響；而Pomoponio等[4]指出12周的超低溫凍藏保存會降低脂肪和蛋白質(zhì)的氧化；夏秀芳等[5]、李靖等[6]也對不同凍藏時間的豬肉作了品質(zhì)研究。在這些研究中均發(fā)現(xiàn)豬肉在凍藏5~7個月后，會出現(xiàn)品質(zhì)的顯著劣變，因此一般認(rèn)為豬肉在?18 ℃下的推薦冷凍儲藏時間應(yīng)少于6個月。然而，目前的多數(shù)研究大都從食品安全的角度注重凍藏過程中肉的變化，以及品種或溫度等因素的影響。而對凍藏過程中不同凍藏期豬肉質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的變化，特別是冷凍儲藏過程中物理和化學(xué)因素引起的變化機(jī)制缺乏清楚的認(rèn)識。

本文以冷凍儲藏時間為4個月和8個月的豬肉樣品為對象，分別檢測其持水力、質(zhì)構(gòu)、顏色、pH、氣味等品質(zhì)方面的變化，并通過掃描電鏡、低場核磁共振技術(shù)（LF-NMR）和基于高分辨質(zhì)譜的脂質(zhì)組學(xué)，對肌原纖維、肉中水分分布變化及可能影響風(fēng)味的潛在化學(xué)變化進(jìn)行了表征，在一定程度上闡明不同冷凍儲藏期豬肉質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的變化，以及引起其質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味發(fā)生變化的機(jī)制，為進(jìn)一步改進(jìn)凍藏工藝延長冷凍儲藏期奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉樣品 市售。

PEN3便攜式電子鼻系統(tǒng) 德國Airsense公司；FDU-1200冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株會會社；902-ULTS超低溫冰箱 賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；5810R冷凍離心機(jī) 德國Eppendor公司；X500R高分辨飛行時間質(zhì)譜儀 美國SCIEX公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；JA5003B型電子天平（精度0.001 g）上海精科儀器有限公司；低場核磁共振儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬肉的貯藏及處理 不同凍藏時間的豬肉樣品：選取市售屠宰后48 h的豬背最長肌，將肉樣裁切成4 cm×4 cm×4 cm的肉塊，裝入食品包裝袋中真空密封，采用配對分組后，于?18 ℃下冷凍貯藏。分別在凍藏4個月和8個月后，取出浸置于液氮內(nèi)待測。

先將肉樣在4 ℃冰箱中化凍24 h，中心溫度為4 ℃后，再檢測相應(yīng)指標(biāo)。其中豬肉的凍融損失率測量依據(jù)Kim等[7]的方法檢測，豬肉的汁液（滴落）損失率、離心損失率、蒸煮損失率和肉樣的顏色、pH依據(jù)“NY/T 2793-2015肉的食用品質(zhì)客觀評價方法”進(jìn)行檢測。其中凍融損失率、汁液（滴落）損失率、離心損失率、蒸煮損失率計算公式如下：

1.2.2 肉樣的質(zhì)構(gòu)檢測 根據(jù)Shen等[8]的方法稍作修改進(jìn)行不同凍藏時間豬肉樣的質(zhì)構(gòu)分析。使用鋁制圓柱形探頭（SMSP/36R），采用TPA模式，將樣品肌纖維方向與探頭平面垂直，以觸發(fā)值10 g、試驗前速度1.0 mm/s壓縮至原高度的50%，壓縮2次，試驗速度為2.0 mm/s，試驗后速度為10.0 mm/s，測定樣品尺寸為2×2×4 cm3。每組6個平行樣，計算每個樣品的硬度、彈性、黏聚性、膠著性、咀嚼性、回復(fù)性參數(shù)。

1.2.3 掃描電鏡（SEM）觀察 按胡春輝等[9]的方法進(jìn)行，即將凍藏不同時間的樣品，凍干處理，再將凍干樣品進(jìn)行噴金處理后，于掃描電子顯微鏡上觀察、拍照。

1.2.4 豬肉低場核磁檢測 豬肉樣品在4 ℃下解凍后，順肌肉纖維方向切割成重量約3.00 g的肉塊，用濕濾紙擦拭干樣品表面水分，放入核磁樣品管中進(jìn)行低場核磁共振測定，每組設(shè)置4個平行樣。選擇自旋回波（carr-purcell-meiboomgill，CPMG）脈沖序列進(jìn)行樣品的測試。測試條件為：氫質(zhì)子共振頻率23 MHz，測定溫度32±0.02 ℃、采樣頻率（SW）100 kHz，回波數(shù)（NECH）3000，回波時間（TE）1.00 ms，重復(fù)2次，等待時間（TW）2500 ms，90°脈寬（P1）10.00 us，180°脈寬（P2）20.0 us，采樣點數(shù)（TD）=150028，O1=940152.75，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用核磁共振反演軟件（MuhiExpInvAnaly）得到樣品中水分橫向弛豫時間T2的反演圖譜，以表征不同樣品中不同組分的水分弛豫時間及峰面積。同時對樣品的水分分布進(jìn)行造影成像，成像層數(shù)為3，層寬4.5~5.0 mm調(diào)整合適的層間距使得掃描范圍基本覆蓋樣品，圖片經(jīng)偽彩處理，顏色越亮，代表水分越多。

1.2.5 電子鼻檢測 將豬肉樣品化凍后均勻打碎，取5 g樣置于20 mL的頂空瓶中，再加入8 mL的蒸餾水，加蓋密封。將頂空瓶于95 ℃的水浴鍋中加熱15 min，冷卻到40 ℃下通過電子鼻檢測系統(tǒng)檢測。樣品的檢測參數(shù)為：洗氣時間90 s、調(diào)零時間5 s、樣品準(zhǔn)備時間5 s、進(jìn)樣時間90 s、流速300 mL/min。

1.2.6 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀對肉樣品的檢測

1.2.6.1 脂類代謝物的提取 將凍藏4月組和凍藏8月組樣用研缽在液氮環(huán)境下研磨成粉末；稱取100 mg粉末樣于2.0 mL EP管中，加入1.0 mL預(yù)冷的提取液（乙腈:甲醇:水=2:2:1）渦旋30 s，置于?20 ℃冰箱中孵育4 h（每30 min渦旋60 s）；在4 ℃ 10000 g條件下離心15 min后，取上清于干凈EP管中，低溫保存，往沉淀中加入0.5 mL提取液（乙腈:甲醇:水=2:2:1）渦旋30 s，置于?20 ℃冰箱中孵育1 h；離心后合并兩次上清液，低溫冷凍干燥揮干溶劑后，用100 μL復(fù)溶液（乙腈:水=1:1）復(fù)溶，冰浴超聲10 min后，渦旋30 s再次離心5 min后，取上清過0.22 μm尼龍濾膜，待測。

1.2.6.2 液相條件與質(zhì)譜條件 液相條件：采用Waters-ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），進(jìn)樣體積為3 μL，流動相為0.1%甲酸溶液?0.1%甲酸的乙腈，流速為0.3 mL/min，采用梯度洗脫，流動相梯度洗脫程序見表1。

表 1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

質(zhì)譜條件：ESI離子源，檢測方式：信息依賴掃描模式（IDA）；霧化氣（GS1）：50 psi，輔助加熱氣（GS2）：50 psi，氣簾氣（Curtain Gas）：35 psi，離子源溫度（TEM）：500 ℃，離子源噴霧電壓（IS）：4500 V，出口電壓（CXP）：7.0 V，碰撞氣（CAD）：8 psi，去簇電壓（DP）80 V，碰撞電壓（CE）30 eV。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS24.0處理并進(jìn)行差異顯著性分析和Pearson相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，電子鼻是以不同傳感器相應(yīng)值為不同維度數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Markerview進(jìn)行峰對齊、峰識別、特征峰提取、基線校準(zhǔn)、降噪和同位素去除，數(shù)據(jù)在MetaboAnalyst平臺（https://www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行Pareto scaling均一化，采用進(jìn)行PLS-DA多元統(tǒng)計分析，此外利用VIP值、載荷圖進(jìn)行潛在標(biāo)志性差異代謝物的篩選，圖像采用origin2019制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肉品質(zhì)分析

2.1.1 持水性測試 以“NYT 2793-2015”中的指標(biāo)作為參考標(biāo)準(zhǔn)，從表2可知，經(jīng)過4個月凍藏后的豬肉的離心損失和蒸煮損失方面仍然滿足標(biāo)準(zhǔn)的要求，而凍藏8個月后，僅剩離心損失符合要求；但在凍藏4月組和凍藏8月組之間除滴落損失存在顯著差異（P<0.05），其他的損失率均存在極顯著的差異性（P<0.01）。整體而言凍藏8月組的損失率較凍藏4月組更大。是由于凍藏過程中水分形成冰晶破壞了肌纖維細(xì)胞，造成肉的保水能力下降，使得凍融損失率、離心損失率、滴落損失率和蒸煮損失率顯著上升[10]。

表 2 不同凍藏時間豬肉持水力測試結(jié)果（n=8）Table 2 Test results of water holding capacity of pork during different frozen storage time(n=8)

2.1.2 質(zhì)構(gòu)測試 由表3可知不同凍藏時間的豬肉在硬度、彈性、膠著性和咀嚼性上具有極顯著差異（P<0.01），而黏聚性和回復(fù)性上無顯著差異。硬度的變化可能是由于膠原蛋白酶或者內(nèi)源性酶使得肌原纖維蛋白發(fā)生水解[11]，或長期的凍藏使得冰晶生長成大冰晶對于肌原纖維產(chǎn)生不可逆的機(jī)械損傷[12]。而彈性、膠著性、咀嚼性的劣變，則可能是肌原纖維中的肌動蛋白、肌球蛋白的變化[13]使得肌肉組織中結(jié)合力的下降以及非極性疏水基團(tuán)的暴露和汁液的損失造成。

表 3 不同凍藏時間豬肉質(zhì)構(gòu)測試結(jié)果（n=12）Table 3 Pork texture test results during different frozen storage time (n=12)

2.1.3 顏色及pH測試 通過表4可以看出，不同凍藏時間下，凍藏豬肉的顏色和pH均具有顯著性差異，就顏色而言，L*值表示樣品的通透性，一般而言，L*值越小，樣品的透光性差，樣品的色澤越深；a*值是指顏色的紅綠色，正值是紅色方向，負(fù)值是綠色方向；b*值指顏色的黃藍(lán)色，正值是黃色，負(fù)值是藍(lán)色。表4中的數(shù)據(jù)顯示，不同凍藏時間的豬肉樣，凍藏4月組的L*值小于凍藏8月組，其透光性較差，而凍藏4月組的b*值顯著小于凍藏8月組（P<0.05），說明長期凍藏會導(dǎo)致肉色變黃，雖a*值在兩組之間不存在顯著性差異，但在肉眼觀察下，凍藏8月組的肉樣顏色明顯接近于白色，可能是血紅素被氧化以及肌纖維細(xì)胞中肌紅蛋白的減少導(dǎo)致。

表 4 不同凍藏時間豬肉顏色及pH測試結(jié)果（n=8）Table 4 Pork color and pH test results during different frozen storage time (n=8)

pH是反映肉的品質(zhì)的重要指標(biāo)，由表4可知凍藏4月組和凍藏8月組之間的pH具有顯著性差異，但是其組間差異較小，它們統(tǒng)計學(xué)意義反映該變異量間的低差異性，該結(jié)果在Daszkiewicz等[14]的報告中得到相似的結(jié)果。

在凍藏過程中，肌肉內(nèi)的水分逐漸形成小冰晶隨著凍藏時間的增加冰晶破壞肌原纖維細(xì)胞逐漸形成大冰晶，對肌原纖維破壞進(jìn)一步加深使得肌肉組織的保水力下降，同時肌動蛋白和肌球蛋白等蛋白的結(jié)合力下降，解凍后喪失了對水分子、無機(jī)物、色素小分子的束縛，同時長時間的凍藏肉質(zhì)發(fā)生氧化使得豬肉顏色發(fā)生不良變化。

2.2 豬肉SEM

為了解經(jīng)過不同凍藏時間的豬肉樣品肌原纖維的變化，可通過SEM觀察，結(jié)果如圖1所示。通過對比同一放大倍數(shù)下的不同的肉樣，可以觀察到，凍藏8個月的樣品，其肌纖維間隙以及肌纖維的斷裂程度比凍藏4個月的樣品大。在Stanislawczyk等[15]的研究中也發(fā)現(xiàn)肉的冷凍過程中，品質(zhì)的變化和肌肉細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成有密切關(guān)系，這可能導(dǎo)致了肌肉組織毛細(xì)結(jié)構(gòu)的松弛，肌肉纖維的間隙增大，使得肌肉組織持水力下降，破壞了肌肉原有的結(jié)構(gòu)。因此可以認(rèn)為經(jīng)過較長時間的凍藏（8個月）后，由于肌肉組織結(jié)構(gòu)的變化引起肉硬度、膠著性、彈性、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)變化，從而產(chǎn)生顯著的品質(zhì)劣變。

圖 1 不同凍藏時間樣品掃描電鏡結(jié)構(gòu)圖Fig.1 SEM structure diagram of samples during different frozen storage time

2.3 豬肉水分分布測試

低場核磁共振（Low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)作為一種快速無損檢測技術(shù)[16]在食品水分分布檢測中被廣泛應(yīng)用[17?18]，其主要通過檢測水分的橫向弛豫時間（T2）來反映水分的結(jié)合狀態(tài)，弛豫時間T2越大代表水分的自由度越高，水分與組織的結(jié)合力越弱[19]。通常弛豫時間T2由小至大的順序可將樣品中的水分分為結(jié)合水（T20）、不易流動水（T21）和自由水（T22）。

為了解經(jīng)過不同凍藏時間的豬肉樣品在肌肉組織中的水分分布，通過LF-NMR檢測，結(jié)果見表5和圖2。由表5可知不同凍藏時間豬背最長肌中不易流動水（T21）和自由水（T22）的弛豫時間存在顯著變化（P<0.05）。結(jié)合不同凍藏時間豬肉樣品的弛豫時間T2反演譜圖（圖2），可知凍藏4月組、凍藏8月組雖然均存在結(jié)合水（T20）、不易流動水（T21）和自由水（T22）峰圖，但結(jié)合水（T20）和不易流動水（T21）的峰頂點隨著凍藏時間的增加存在明顯的向右偏移，T20、T21和T22的峰面積也隨著凍藏時間的增加而顯著減少（P<0.05）。

圖 2 不同凍藏時間豬肉的二維T2弛豫時間圖譜Fig.2 Diagram of T2 relaxation time of pork during different freezing storage time

由于結(jié)合水是在蛋白質(zhì)大分子的周圍，借助于分子表面的極性基團(tuán)與水分子之間的靜電引力而形成的一薄水層，結(jié)合的非常牢固，既不易蒸發(fā)更不易凍結(jié)[20]。而Bertram等[21]的研究認(rèn)為不易流動水位于肌原纖維之間和肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，凍藏過程中溫度的波動易行成冰晶生長，而大冰晶的形成對肌原纖維形成破壞，導(dǎo)致不易流動水發(fā)生遷移或流失，自由水則存在于細(xì)胞間隙或組織間，樣品在凍藏過程中細(xì)胞破裂，再經(jīng)過凍融后水分基本流失，導(dǎo)致不易流動水及自由水峰面積占比下降。因此可以認(rèn)為經(jīng)過較長時間的凍藏（8個月）后，肌肉纖維會發(fā)生較大程度的不可逆損傷（SEM的結(jié)果也證實了這點），同時組織、細(xì)胞等結(jié)構(gòu)也可能破壞，解凍后肌纖維和網(wǎng)狀組織的持水性降低，使得不易流動水發(fā)生遷移，自由水發(fā)生流失。

表 5 不同凍藏時間豬背最長肌中3種狀態(tài)水分的弛豫時間及峰面積變化Table 5 Relaxation time and peak area changes of the three states of water in the longissimus dorsi muscle during different frozen storage time

低場核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術(shù)通過對樣品中H+信號采集獲得H+密度圖像，通過軟件處理添加偽彩獲得彩色或黑白圖像[21]，形象的顯示樣品中水分分布狀況。

通過對不同凍藏時間豬肉的肌纖維層進(jìn)行H+質(zhì)子密度成像，結(jié)果如圖3所示。通過樣本不同位置的H+質(zhì)子密度成像圖對比發(fā)現(xiàn)，同一組樣本的不同區(qū)域內(nèi)水分的分布具有差異，而不同組同一區(qū)域內(nèi)水分的分布也具有明顯差異；在凍藏4月組中水分分布較為集中，多數(shù)水分集中于樣品內(nèi)部和中心，邊緣的水分較少，顏色較暗，而凍藏8月組中水分分布較為分散、均勻，其邊緣水較多，顏色較亮。李靖等[6]的研究指出在凍藏過程中由于冰晶對肌肉纖維等組織結(jié)構(gòu)的破壞嚴(yán)重，解凍后對其水分子的束縛力減弱或改變了與水的結(jié)合方式，使得水分在豬肉中發(fā)生了遷移。此外水分的遷移又促使蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)變化而暴露其疏水性水基團(tuán)，進(jìn)一步降低水分在肌肉組織內(nèi)部的結(jié)合力[22]。因此經(jīng)過較長時間的凍藏（8個月）后，水分在肌肉的結(jié)合力大大降低，呈現(xiàn)出水分向四周遷移的現(xiàn)象，其凍融損失率、離心損失率、滴落損失率和蒸煮損失率也顯著增加（P<0.05或P<0.01）。

圖 3 不同凍藏時間豬肉的MRI圖譜Fig.3 MRI of pork during different freezing time

圖 4 不同凍藏時間豬肉電子鼻數(shù)據(jù)的PLS-DA分析（n=7）Fig.4 PLS-DA analysis of pork electronic nose data during different frozen storage time (n=7)

2.4 品質(zhì)指標(biāo)與凍藏時間及水分分布指標(biāo)間的相關(guān)性

由表6可知，豬肉的硬度、膠著性、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)和凍融損失率、蒸煮損失率等持水性指標(biāo)與凍藏時間及各類水分分布的指標(biāo)具有顯著的相關(guān)性（P<0.05或P<0.01）。而肌肉中各類水分的穩(wěn)定與保持則依賴于肌纖維組織和肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性[23]。但在很多研究中發(fā)現(xiàn)在肉制品凍藏過程中，由于凍庫中存在的溫度波動等影響因素，會引起肌肉中冰晶的生長和重結(jié)晶，從而使肌肉中的水分從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外遷移。其后果是水分在細(xì)胞外形成大冰晶破壞肌纖維和肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)形成高滲溶液造成蛋白變性進(jìn)一步加劇細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞[24?25]。而已有的研究也表明凍藏過程中冰晶的生長對細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的破壞會造成水分的損失，進(jìn)而對豬肉的質(zhì)地、嫩度、切片性、彈性以及口感產(chǎn)生直接相關(guān)的影響[20]。這表明凍藏過程中豬肉品質(zhì)劣變的主要因素是經(jīng)過較長時間的凍藏后因肌纖維和細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞而使的結(jié)合水與不易流動水的遷移與損失。因此凍藏過程中如何保持肌細(xì)胞和肌纖維的結(jié)構(gòu)完整，是防止凍藏過程中質(zhì)構(gòu)劣變的關(guān)鍵因素。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，采用糖醇[26]、多糖[27]等冷凍保護(hù)劑可以顯著抑制冰晶生長，保持肌肉組織完整，對于改善凍藏水產(chǎn)品的品質(zhì)具有較好的效果。

表 6 品質(zhì)指標(biāo)與影響因素間的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis between quality indicators and influencing factors

2.5 豬肉風(fēng)味分析

除質(zhì)構(gòu)的劣變外，風(fēng)味的變化也是影響凍藏豬肉品質(zhì)的重要因素。采用電子鼻對凍藏4月組和凍藏8月組樣品進(jìn)行檢測，將數(shù)據(jù)通過偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）獲得散點圖和VIP值如圖4所示。在PLS-DA分析中，用于生成散點圖的判別因子的貢獻(xiàn)度達(dá)到94.8%，從圖4a可知，凍藏4月組和凍藏8月組樣品可以被完全區(qū)分，表明經(jīng)過較長時間的凍藏（8個月）后其風(fēng)味成分也已經(jīng)發(fā)生了顯著的改變。而從圖4b可知，對區(qū)分貢獻(xiàn)率VIP值大于1的傳感器分別是W1C、W3C、W5C、W2S和W1S，其中W1C、W3C、W5C對應(yīng)識別組分主要為烷烴、芳香類成分及弱極性化合物，其響應(yīng)值在經(jīng)過較長時間的凍藏后顯著降低；W2S和W1S對應(yīng)識別組分主要為甲烷和醇類，其響應(yīng)值則隨凍藏時間的增加而顯著升高。在Cabral等[28]的研究中指出含不同脂肪含量的牛胸肉餅香氣成分的差異主要受醛類、脂肪酸類、甲烷以及硫醇等物質(zhì)的影響，這暗示了凍藏過程中肉樣風(fēng)味的改變可能與脂肪類的變化有關(guān)。

2.6 豬肉標(biāo)志性化合物分析

為了解凍藏過程中豬肉中脂類發(fā)生的變化，采用基于高分辨質(zhì)譜的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對經(jīng)過不同凍藏時間的豬肉樣品進(jìn)行研究。不同凍藏時間組豬肉中代謝物的Heatmap圖如圖5所示，經(jīng)過不同凍藏時間的豬肉樣品的脂類代謝物輪廓發(fā)生了明顯變化。對不同代謝物豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析的結(jié)果見圖6，由圖6a可知凍藏4個月組和凍藏8個月組的樣本可由總貢獻(xiàn)率為66.2%的判別因子完全分離，說明經(jīng)過較長時間的凍藏（8個月）后豬肉中化合物與短時間凍藏（4個月）的豬肉也存在明顯差異。對區(qū)分不同凍藏時間樣品具有重要作用的差異化合物多達(dá)107種（VIP>1），圖6b顯示了VIP>3的差異化合物的母離子精確質(zhì)荷比（M/Z）及其豐度變化趨勢。通過將這些差異代謝物的母離子精確質(zhì)量數(shù)及其二級質(zhì)譜圖，與各類化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（www.lipidmaps.org、massbank.us、www.hmdb.ca、pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行搜索比對，共鑒定出5種差異代謝物（表7），但是其余差異代謝物由于質(zhì)譜庫中信息缺乏不能鑒定出確定的化合物，但從其二級質(zhì)譜圖的特征隨碎片可推測其中多數(shù)為脂類氧化物。

圖 5 不同凍藏時間豬肉代謝物質(zhì)數(shù)據(jù)heatmap圖（n=6）Fig.5 Heat map of pork metabolite data during different frozen storage time (n=6)

圖 6 不同凍藏時間豬肉質(zhì)譜數(shù)據(jù)PLS-DA結(jié)果（n=6）Fig.6 PLS-DA results of mass spectrometry data of pork during different frozen storage time (n=6)

其中PC（18:2（9Z,12Z）/P-16:0）、PC（O-16:0/20:4（5E,8E,11E,14E））、PC（O-16:0/20:4（5E,8E,11E,14E））物質(zhì)的含量隨凍藏時間的增加而升高，LAnserine（L-鵝肌肽）、Niacinamide（煙酰胺）隨凍藏時間的增加而減少。在Wang等[29]的研究表明PC類主要來源于脂肪酸和磷脂區(qū)，其含量隨凍藏時間的增加而升高可能由于肌肉中脂類的氧化，而其它未被鑒別出的脂類氧化物的含量也呈現(xiàn)出升高的趨勢。另外有研究表明L-Anserine是一種甲基化的L-carnosine（L-肌肽）[30]，后者是一種二肽具有螯合金屬離子的能力，具有抑制脂肪氧化的作用[31]。而Burgess[32]的研究也指出Niacinamide屬于維生素B-3類，具有顯著的抗氧化活性。這兩類化合物含量的減少可能是凍藏過程中被氧化降解所消耗導(dǎo)致的。而Johnston等[33]的研究證明加入蜂蜜可以通過抑制脂質(zhì)氧化來改善即食絞碎牛肉餡餅的風(fēng)味。這些結(jié)果都表明凍藏過程中對脂類的氧化作用可能是引起豬肉風(fēng)味變化的主要原因。

表 7 UPLC-Q-TOF分析凍藏不同時間豬肉代謝物生物標(biāo)志物Table 7 UPLC-Q-TOF analysis of biomarkers of metabolites in frozen pork during different time

3 結(jié)論

凍藏8個月后的豬肉在持水性、質(zhì)構(gòu)、顏色、微觀形貌和風(fēng)味等品質(zhì)指標(biāo)上，與凍藏4個月的樣品相比發(fā)生了十分顯著的劣變，凍藏過程中冰晶對肌細(xì)胞和肌肉纖維的破壞程度加重，引起豬肉中結(jié)合水和不易流動水的遷移與損失，可能是引起豬肉質(zhì)構(gòu)品質(zhì)發(fā)生劣變的誘因。凍藏4個月和8個月的豬肉在風(fēng)味上差異明顯，引起風(fēng)味差異的主組分主要為烷烴、芳香類成分、弱極性化合物、甲烷及醇類化合物。基于高分辨質(zhì)譜的脂質(zhì)組學(xué)的檢測結(jié)果顯示經(jīng)過較長時間的凍藏（8個月）后，豬肉風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生的明顯變化，可能是由于肌肉組織中的脂類被氧化造成的，部分化合物變化趨勢上存在上、下調(diào)，這樣的趨勢對于豬肉凍藏時間的確定方法具有十分重要的研究價值。