斑蝥酸鈉注射液靶向PI3K／AKT／mTOR信號通路對人肺腺癌細(xì)胞A549遷移能力的影響*

房傳賜，錢亞云

揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225001

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率與死亡率均居所有癌癥首位［1］。早期肺癌多采用手術(shù)治療的方式，但肺癌的高轉(zhuǎn)移性與高侵襲性使得多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期［2－3］。因此，肺癌的治療多采用手術(shù)為主，化療聯(lián)合中醫(yī)藥治療的綜合治療方案［4］。

中醫(yī)認(rèn)為，肺癌為本虛標(biāo)實(shí)之證，臨床治療肺癌在扶正的基礎(chǔ)上，多與“清熱解毒”“化痰散結(jié)”以及“活血化瘀”等祛邪法相結(jié)合［4］。斑蝥味辛，性熱，具有破血逐瘀、散結(jié)消瘸、攻毒蝕瘡的功效，斑蝥素是其主要成分，具有很強(qiáng)的抗癌作用，但同時具有較強(qiáng)的毒副反應(yīng)。運(yùn)用現(xiàn)代工藝提取得到的斑蝥酸鈉既保留了斑蝥素的抗癌作用，也使其毒性大大降低［5］。以斑蝥酸鈉為主要成分的斑蝥酸鈉注射液作為肺癌的輔助化療藥物，較廣泛應(yīng)用于臨床［6］，但對于肺癌的具體作用機(jī)制尚未明確。

磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3 kinases／protein kinase B／mammalian target of rapamycin，PI3K／AKT／mTOR）信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，影響腫瘤細(xì)胞的血管生成及侵襲與轉(zhuǎn)移能力［7］。本研究探究了斑蝥酸鈉注射液干預(yù)下肺腺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移能力的變化，并初步探討對PI3K／AKT／m TOR信號通路蛋白表達(dá)的影響，為斑蝥酸鈉對肺癌相關(guān)疾病的作用機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞株人肺腺癌A549細(xì)胞，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，于37℃、5%CO2的條件下，采用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑順鉑（cisplatin，DDP）注射液（江蘇豪森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20040813）；斑蝥酸鈉注射液（貴州金橋藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字：H52020601）。MTT粉末、胰蛋白酶（美國Sigma公司，批號：M2003、J170013）；1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號：SH30809.01）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司，批號：10437028）；細(xì)胞裂解緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天公司，批號：P0013、P0010）；PI3K、AKT、mTOR、P70 S6、GAPDH抗體（美國Cell Signaling Techology公司，批號：4249、4691、2983、2708、5174）；VEGF－C抗體（美國Abcam公司，批號：ab191274）；HRP標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（華安生物公司，批號：G170628）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Bio－Rad公司，批號：1705062）。

1.3 儀器Heracell 150i型恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；1X71型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Universal HoodⅡ型SDS－PAGE凝膠成像分析儀、721BR08904型蛋白電泳槽（美國Bio－Rad公司）；Enspire型多功能酶標(biāo)儀（美國Perkinelmer公司）。

2 方法

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為5×104mL－1。96孔板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液，并分別 加 入 含0 mg·L－1、0.312 5 mg·L－1、0.625 mg·L－1、1.25 mg·L－1、2.5 mg·L－1、5 mg·L－1蝥酸鈉注射液的10%FBS培養(yǎng)基100μL，設(shè)5個平行孔，處理24 h、48 h、72 h后，棄去上清，每孔加入20μL MTT溶液，4 h后吸除上清液，加入150μL DMSO，低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率。

腫瘤細(xì)胞增殖抑制率＝（1－藥物組OD值／對照組OD值）×100%

2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔約5×104個細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿后沿中線劃出2 mm左右劃痕，PBS清洗3次，加入無血清培養(yǎng)基，設(shè)空白對照組（control）、斑蝥酸鈉注射液低劑量組（0.4 mg·L－1）、斑蝥酸鈉注射液高劑量組（1 mg·L－1）、順鉑組（DDP，2 mg·L－1），置入培養(yǎng)箱，24 h后記錄各孔劃痕的距離。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn)A549細(xì)胞分組同2.2，孵育24小時后，用細(xì)胞裂解緩沖液在冰上提取30 min，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取25 ng待測樣品進(jìn)行10%SDS－PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（1∶1 000）孵育過夜，二抗（1∶2 000）孵育2 h，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描各蛋白條帶灰度值，以待測蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為待測蛋白的相對表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測不同濃度斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞增殖能力的影響。藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h后，斑蝥酸鈉注射液能夠明顯抑制A549細(xì)胞的增殖（P＜0.05，P＜0.01），且具有濃度與時間依賴性。見圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取24 h為藥物干預(yù)時間，計(jì)算斑蝥酸鈉注射液干預(yù)A549細(xì)胞24 h后，其半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibition concentration，IC50）為1.58 mg·L－1。

圖1 斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞增殖的影響

3.2 斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞遷移能力的影響。與對照組比較，經(jīng)不同濃度斑蝥酸鈉注射液處理后，各孔細(xì)胞遷移率顯著降低（P＜0.05），提示斑蝥酸鈉注射液能夠抑制細(xì)胞遷移，并呈濃度依賴性。見圖2。

圖2 斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞遷移能力的影響（×200）

3.3 斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞PI3K／AKT／mTOR通路蛋白表達(dá)的影響為探討斑蝥酸鈉注射液抑制A549細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，用Western blot檢測PI3K／AKT／mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。與對照組比較，斑蝥酸鈉注射液處理后，PI3K、AKT、mTOR、P70 S6及VEGF－C的蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。表明斑蝥酸鈉注射液可能通過抑制PI3K／AKT／mTOR通路激活而抑制A549細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。見圖3。

圖3 斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞中PI3K／AKT／mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

4 討論

惡性增殖和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特點(diǎn)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，因此，抑制細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移是治療惡性腫瘤的重要策略之一［8］。斑蝥是常用的抗腫瘤蟲類中藥，斑蝥酸鈉是其主要成分斑蝥素的小分子衍生物［9］。斑蝥酸鈉注射液在多種腫瘤治療中均有良好效果［10－12］，在肺癌的治療中亦有應(yīng)用。研究表明，斑蝥酸鈉注射液聯(lián)合化療治療非小細(xì)胞肺癌，能夠提高治療的總有效率，且聯(lián)合組患者治療后血清中VEGF水平明顯低于常規(guī)化療組患者，而腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factorα，TNF－α）和白細(xì)胞介素－12（interleukin－12，IL－12）水平明顯高于常規(guī)化療組患者［13］。

本研究采用不同濃度斑蝥酸鈉注射液干預(yù)A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到抑制，且與濃度和時間呈現(xiàn)明顯依賴性。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞向中心遷移的能力受抑制。這些結(jié)果均表明斑蝥酸鈉注射液可抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移，具有明顯的抗腫瘤活性。

為進(jìn)一步探討斑蝥酸鈉注射液抑制A549細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，本文研究了斑蝥酸鈉注射液對A549細(xì)胞PI3K／AKT／mTOR信號通路的影響。PI3K／AKT／mTOR信號通路在腫瘤研究中起重要作用［14］，該通路的異常激活能夠抑制腫瘤的凋亡與自噬［15－16］，促進(jìn)腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移［17］，影響腫瘤微環(huán)境［18］等。而大約90%的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，包括A549細(xì)胞，均存在PI3K／AKT／mTOR通路的激活［19］，其中，PI3K的亞單位p85a和p115a均呈現(xiàn)過表達(dá)的現(xiàn)象，而PI3K下游的信號因子AKT也因此呈現(xiàn)活化狀態(tài)，活化的AKT能夠促進(jìn)糖原合成酶激 酶－3β（glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β）、叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)OXO）轉(zhuǎn)錄因子、核轉(zhuǎn)錄因子－κB（nuclear factorκB，NF－κB）等多個基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［20］。mTOR作為PI3K／AKT的下游信號因子，因PI3K／AKT的激活而呈活化狀態(tài)。研究表明，mTOR能夠參與調(diào)控上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transformation，EMT），調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子，影響腫瘤免疫微環(huán)境等多種細(xì)胞進(jìn)程，從而影響肺癌細(xì)胞的增殖與遷移［21－23］。Western Blot實(shí)驗(yàn)表明，斑蝥酸鈉注射液能夠明顯下調(diào)A549細(xì)胞中PI3K／AKT／mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。因此，斑蝥酸鈉注射液抑制A549細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制可能與抑制PI3K／AKT／mTOR通路激活有關(guān)。

同時，PI3K／AKT可在基因水平上促進(jìn)VEGF的合成［24］，VEGF－C作為VEGF家族中的一員，能夠促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移，是誘導(dǎo)淋巴管生成的重要指標(biāo)［25］，且在肺癌中高表達(dá)，與肺癌的增殖與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［26］。已有研究表明，斑蝥酸鈉能夠有效抑制胃癌、肝癌等惡性腫瘤中VEGF－C的表達(dá)［27－28］，但對于肺癌中VEGF－C表達(dá)的影響鮮有報(bào)道。本研究表明，斑蝥酸鈉注射液干預(yù)A549細(xì)胞后，VEGF－C的表達(dá)亦被抑制，表明斑蝥酸鈉注射液抑制A549細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移可能的作用機(jī)制還可能與抑制血管生成有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，斑蝥酸鈉注射液能夠抑制A549細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與抑制PI3K／AKT／mTOR信號通路激活及血管生成有關(guān)。