基于TGF－β1／Smad通路研究牛膝多糖對慢阻肺模型大鼠的作用機制*

吳娜娜，李梅霞，韓曉環

中國人民解放軍第九八八醫院焦作院區，河南 焦作 454002

慢阻肺全稱為慢性阻塞性肺疾病，在全球范圍內患病率和死亡率均呈現逐年升高的趨勢，并居于全球死亡原因的第四［1］，主要表現為氣流受限，嚴重者最終發展為慢性呼吸衰竭或慢性肺源性心臟病，嚴重威脅患者生命安全，影響患者的生活質量。目前西醫治療雖對患者臨床癥狀有緩解效果，但均無法逆轉慢阻肺的進展［2］。氣道重塑是慢阻肺氣流阻的重要病理機制之一，基質金屬蛋白酶組織抑制因子－1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase－1，TIMP－1）、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是氣道重塑的相關蛋白，參與并促進氣道重塑的過程，檢測患者血清TIMP－1、VEGF、OPN水平可反映氣道重塑程度。牛膝多糖為中藥牛膝的提取物，具有水溶性好，來源廣泛，具有較好的應用前景［3］。研究表明，牛膝多糖可緩解支氣管哮喘大鼠氣道炎癥，改善氣道重塑［4］。牛膝多糖對慢阻肺的氣道重塑有改善效果目前尚未見報道。轉化生長因子（transforming growth factor－β1，TGF－β1）／Smad通路在氣道重塑過程中發揮著重要作用。研究表明，TGF－β1／Smad通路激活促進慢阻肺模型大鼠氣道重塑的發生與發展［5］。因此，本研究基于TGF－β1／Smad通路，研究牛膝多糖對慢阻肺大鼠氣道重塑的改善作用，為牛膝多糖在臨床應用提供基礎依據。

1 材料

1.1 動物4～6周齡60只無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠，雌雄各半，體質量180～220 g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2016－0001，飼養條件：12 h光照12 h黑暗，溫度（25±2）℃，相對濕度40%～60%，自由飲食、進水，倫理批號：JZHPLA190620 006。

1.2 藥物與試劑牛膝多糖（純度≥99%。武漢東康源科技有限公司，批號：20190511）；地塞米松片（石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號：190621A）。黃鶴樓牌香煙（湖北中煙工業有限責任公司，含焦油量8 mg，煙氣煙堿含量0.8 mg，煙氣一氧化碳量9 mg；貨號：C201903）；脂多糖（美國Sigma公司，批號：190416）；生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司，批號：190315）；蘇木精－伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（湖北安立信醫療實業有限公司，批號：Y20190806）；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒均（美國Promega公司，批號分別為：R190106、R190108）；細胞裂解液（北京索萊寶生物科技公司，批號：201910185）；TIMP－1、VEGF、OPN酶聯免疫法試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司，批號分別為：181211、181014、190123）；TGF－β1、Smad2、Smad3、p－Smad2、p－Smad3和β－actin鼠單克隆一抗和兔抗鼠二抗（美國Abcam公司，批號分別為：20190111、20190220、20190125、20190422、20190610、20190524；20190310、20190422、20190213、20190520、20190714、20190610）；引物合成委托北京優博蘭基因技術有限公司。

1.3 儀器Flexivent型小動物肺功能儀（法國EMKA公司）；FPMRC－MIT－45B型切片機（上海輔光精密儀器有限公司）；DYCZ－24DN型迷你雙垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；Varioskan LUX型酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；CX43型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；LA500型醫用離心機（湖南湘儀離心機有限公司）；ProFlex型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 動物分組與模型復制60只SPF級SD大鼠，雌雄各半，隨機選取50只大鼠建立慢阻肺模型，余下10只為對照組。通過煙熏聯合脂多糖法［6］建立慢阻肺模型：分別在建模第1天和第15天向大鼠氣管內滴注1 g·L－1脂多糖200μL。建模第2－13天和第15－40天分別于上午和下午將大鼠置于煙熏箱中被動吸煙0.5 h，每次15只香煙。建模40 d后，隨機挑選3只大鼠取肺組織，HE染色觀察其病理變化判斷大鼠建模是否成功。將建模成功的大鼠隨機分為5組，即模型組，地塞米松組（0.5 mg·kg－1），牛膝多糖 低、中、高 劑 量 組（2 g·kg－1、4 g·kg－1、8 g·kg－1）。給予相應的藥物灌胃，模型組、對照組給予同體積生理鹽水，每天1次，連續30 d。

2.2 肺功能的檢測將大鼠麻醉，對其進行氣管插管，用小動物肺功能儀檢測大鼠吸氣阻力（inspiratory resistance，IR）、呼氣阻力（expiratory resistance，ER）、0.3秒用力呼出氣量占用力肺活量百分比（0.3 second forced expiratory volume／forced vital capacity，FEV0.3／FVC）。

2.3 大鼠氣道重塑相關血清指標的檢測大鼠尾靜脈采血，室溫靜置2 h后，離心分離血清，ELISA試劑盒檢測血清TIMP－1、VEGF、OPN水平。

2.4 大鼠肺組織病理學觀察及氣管壁厚度的檢測

通過HE染色觀察肺組織病變及氣管壁厚度。每組隨機3只大鼠，取右肺同一部位含氣管組織，用中性福爾馬林溶液浸泡固定，石蠟包埋，切成4μm厚，經過脫蠟、復水后，按說明書對切片進行HE染色，光學顯微鏡下觀察隨機5個氣管環，測量其管壁厚度，取平均值。

2.5 Western Blot法檢測大鼠肺組織TGF－β1、Smad2、Smad3、p－Smad2、p－Smad3蛋白表達每組隨機選擇3只大鼠，取肺組織，提取組織總蛋白，定量后蛋白凝膠電泳后，轉膜，脫脂牛奶封閉，加一抗室溫孵育2 h，洗膜3次后，加二抗室溫孵育2 h，洗膜后進行曝光。根據條帶灰度值以β－actin為內參得出目的蛋白相對表達水平。

2.6 RT－PCR法檢測大鼠肺組織中TGF－β1mRNA、Smad2mRNA、Smad3mRNA水平每組隨機選擇3只大鼠，取肺組織，用RNA提取試劑盒提取肺組織中細胞總RNA，反轉錄試劑盒得到互補的脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。設計引物：TGF－β1上游引物：5′－TAGATCGCTTCATCGCATTGA－3′，下游引物：5′－GGACAATTAGCATCCATATCA－3′，產物長度132 bp；Smad2上 游 引 物：5′－TGATCTTAGCACTAGACTCGA－3′，下 游 引 物：5′－TAGATCCGAAGCTCGGAATCA－3′，產物長度110 bp；Smad3上游引物：5′－GATTCATGGCTCAGCTCGAA－3′，下游引物：5′－CGAATACGATACACTCAACGAC－3′，產物長度121 pb；β－actin上游引物：5′－GATAGCTCCTAGAACATAGCAA－3′，下游引物：5′－GATATCGCTCTAGCAACTG－3′，產物長度107 bp。通過配套熒光采集系統得出樣品Ct值，以β－actin為內參基因，按照2－△△Ct計算目的基因的相對表達量。

2.7 統計學方法使用SPSS 21.0對實驗數據進行統計學分析。計量資料若符合正態分布，采用平均值±標準差（±s）描述，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較使用SNK－q檢驗，若不符合正態分布需進行正態性轉化。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 檢測大鼠肺功能對照組、模型組、地塞米松組及牛膝多糖低、中、高劑量組，每組各10只，治療期間因灌胃操作不當導致地塞米松組出現1只大鼠死亡。與對照組比較，模型組大鼠IR、ER均明顯升高，FEV0.3／FVC明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠IR、ER均明顯降低，FEV0.3／FVC明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肺功能檢測結果 （±s）

表1 各組大鼠肺功能檢測結果 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n IR／cm H2O·s·mL－1 ER／cm H2 O·s·mL－1 FEV0.3／FVC／%10 3.05±0.16 2.68±0.15 94.11±7.84模型組 10 4.61±0.45* 3.98±0.59* 62.28±7.56*地塞米松組 9 3.77±0.25＃ 3.21±0.24＃ 82.13±8.07＃牛膝多糖低劑量組10 4.13±0.34＃ 3.57±0.14＃ 73.55±6.51＃牛膝多糖中劑量組10 3.75±0.27＃ 3.19±0.30＃ 80.30±4.03＃牛膝多糖高劑量組10 3.38±0.26＃ 2.91±0.29＃ 89.69±5.79對照組＃

3.2 大鼠氣道重塑相關血清指標檢測與對照組比較，模型組大鼠血清TIMP－1、VEGF、OPN水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠血清TIMP－1、VEGF、OPN水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠氣道重塑相關血清指標檢測結果 （±s）

表2 大鼠氣道重塑相關血清指標檢測結果 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n TIMP－1（ρ／ng·L－1）VEGF（ρ／ng·L－1）OPN（ρ／μg·L－1）10 0.77±0.14 50.35±5.01 15.65±1.33模型組 10 1.26±0.25* 74.40±12.88* 47.33±3.46*地塞米松組 9 0.84±0.18＃ 62.95±6.25＃ 32.11±4.62＃牛膝多糖低劑量組10 1.05±0.13＃ 68.77±3.53＃ 42.31±4.84＃牛膝多糖中劑量組10 0.86±0.11＃ 63.51±5.82＃ 34.59±4.18＃牛膝多糖高劑量組10 0.76±0.08＃ 56.32±4.24＃ 25.10±5.01對照組＃

3.3 大鼠肺組織病理學觀察及氣管壁厚度檢測

對照組大鼠支氣管和肺泡結構完整，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠支氣管纖毛倒伏、粘連，支氣管上皮細胞變性壞死，氣管壁可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁變薄，間隔出現斷裂；地塞米松組和牛膝多糖低、中、高劑量組均出現好轉。見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理學觀察（HE，×100）

大鼠氣管壁厚度檢測結構顯示：與對照組比較，模型組大鼠氣管壁厚度均明顯增厚（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠氣管壁厚度均明顯變薄（P＜0.05）。見表3。

表3 大鼠氣管壁厚度測量結果 （±s）

表3 大鼠氣管壁厚度測量結果 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05

組別 n 氣管壁厚度（l／μm）14.12±1.80模型組 3 29.93±3.68*地塞米松組 3 18.33±2.66＃牛膝多糖低劑量組 3 26.25±2.55＃牛膝多糖中劑量組 3 20.40±2.08＃牛膝多糖高劑量組 3 16.26±2.35對照組3＃

3.4 對大鼠肺組織TGF－β1蛋白及Smad2、Smad3蛋白的磷酸化表達的影響與對照組比較，模型組大鼠肺組織TGF－β1蛋白表達明顯上調，p－Smad2／Smad2、p－Smad3／Smad3水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠肺組織TGF－β1蛋白表達明顯下調，p－Smad2／Smad2、p－Smad3／Smad3水平明顯降低（P＜0.05）。見圖2、表4。

表4 大鼠肺組織TGF－β1蛋白與Smad2、Smad3蛋白的磷酸化水平比較 （xˉ±s）

3.5 大鼠肺組織中TGF－β1mRNA、Smad2mRNA、Smad3mRNA水平的影響與對照組比較，模型組大鼠肺組織TGF－β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，牛膝多糖低、中、高劑量組及地塞米松組大鼠肺組織TGF－β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA水平明顯降低（P＜0.05）。見表5。

表5 大鼠肺組織TGF－β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA相對表達量 （xˉ±s）

4 討論

慢阻肺的致病因素有：香煙、有害氣體、性別、年齡和肺的發育等［7－9］。目前，吸煙被認為是慢阻肺發病的主要致病因素，香煙中所含化學物質可引起細胞損傷，導致炎癥反應［10］。此外，脂多糖是細菌內毒素，可直接刺激細胞產生炎性反應，引起慢性氣管炎和肺氣腫［11］。因此，本研究使用煙熏聯合脂多糖法建立大鼠慢阻肺模型，結果顯示肺功能下降。牛膝多糖為牛膝的主要活性成分之一，具有抗炎、提高免疫力等作用［12－13］。本研究結果顯示，牛膝多糖組大鼠肺功能呼氣和吸氣阻力降低，FEV0.3／FVC升高，表明牛膝多糖對慢阻肺具有一定作用。地塞米松為皮質類固醇，具有抗炎、抗過敏等作用。研究表明，地塞米松可通過TGF－β1／Smad3通路改善哮喘大鼠氣道重塑［14］。因此，本研究選用地塞米松作為陽性對照組。

TIMP－1是基質金屬蛋白酶抑制劑，可與MMP－9特異性結合［15］。研究顯示，TIMP－1可抑制MMP－9對細胞基質的降解，引起基質沉積，最終導致氣道重塑［16］。VEGF可促進血管內皮細胞增殖，促進血管形成，在肺組織中廣泛分布，并在氣管炎癥和重塑過程中發揮著重要作用［17］。研究表明，在哮喘患者血清VEGF顯著高于正常水平，且參與哮喘氣道重塑［18］。OPN是分泌型糖基化磷蛋白，主要在支氣管上皮細胞、巨噬細胞等中表達，并發揮促進細胞增殖、黏附、趨化等作用［19］。研究表明，OPN可影響TGF－β1、VEGF等，促進氣管炎性反應，促進氣管壁增厚，引起氣道重塑［20］。慢阻肺模型大鼠血清TIMP－1、VEGF和OPN水平與氣道重塑緊密相關，而抑制其水平可減輕氣道重塑。本研究結果顯示，慢阻肺模型大鼠血清TIMP－1、VEGF和OPN水平均升高，而經過牛膝多糖治療后大鼠血清TIMP－1、VEGF和OPN水平均降低，與上述相關報道和分析一致，證實牛膝多糖對慢阻肺模型大鼠氣道重塑具有改善作用。

TGF－β1作為一種促纖維化細胞因子，常在肺部疾病中表現出高表達［21］。其可誘導杯狀細胞和成纖維細胞增殖，促進膠原蛋白合成與分泌，加速氣道重塑的過程［22］。Samd是TGF－β1下游靶分子之一，參與調控肺纖維化。TGF－β1可使下游Smad2、Smad3磷酸化，進而調節靶基因的轉錄［23－24］。有報道顯示，使用抑制劑阻斷TGF－β1／Smad通路可有效減少慢阻肺小鼠氣道重塑程度［25－26］。此外，TGF－β1／Smad通路還可影響氣道重塑相關蛋白TIMP－1、VEGF、OPN表達水平［27－28］。研究發現，富馬酸替諾福韋－阿拉芬酰胺可通過調控TGF－β1／Smad通路下調TGF－β1、Smad1、Smad2蛋白表達，抑制肺纖維化，且可改善其肺功能［29］。本研究結果顯示，牛膝多糖可降低慢阻肺模型大鼠肺組織中TGF－β1蛋白表達，p－Samd2／Samd2、p－Samd3／Samd3水 平，TGF－β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA水平，與上述報道相符，推測牛膝多糖對慢阻肺模型大鼠氣道重塑的改善作用可能與抑制TGF－β1／Smad通路有關。

綜上所述，牛膝多糖可提高慢阻肺模型大鼠肺功能，降低TIMP－1、VEGF、OPN水平，降低大鼠氣管壁厚度，對慢阻肺模型大鼠氣道重塑有改善作用，推測其機制可能與抑制TGF－β1／Smad通路有關。本研究僅從TGF－β1／Smad通路討論牛膝多糖對慢阻肺大鼠氣道重塑的改善作用，牛膝多糖是否通過影響其他信號通路對慢阻肺產生治療效果有待進一步研究。