DJ-1和TET1在宮頸癌的表達及臨床意義

朱小雨，譚玉潔

(1.貴州醫科大學醫學檢驗學院，貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院臨床檢驗中心，貴陽 550004)

宮頸癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命健康。隨著篩查技術的不斷提升，其發病率和病死率已經明顯下降，但在發展中國家仍然是女性死亡的重要原因[1]。因此，探究宮頸癌發生、發展的影響因素，發現有效的早期診斷標志物和治療靶點尤為重要。帕金森病相關蛋白7(parkinson protein 7,PARK7/DJ-1)是一種高度保守的蛋白，以同源二聚體的形式廣泛表達于機體各組織細胞，參與轉錄調控、細胞增殖等生理病理活動[2-4]。它以二聚體的形式參與多種病理生理過程的調控，在腫瘤的發生、發展過程中發揮著重要的作用。研究發現DJ-1與肝癌細胞增殖相關[5]，此外，DJ-1在膽管癌中表達上調且與其預后相關[6]。甲基胞嘧啶雙加氧酶(ten eleven translocation 1，TET1)是TET蛋白家族的主要成員之一，是新近發現的一種基因甲基化調節酶，其主要功能是通過將5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)轉化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)，從而發揮DNA去甲基化的作用[7]。DNA甲基化作為表觀遺傳學的重要部分，與腫瘤的發生密切相關。有研究報道，在肝癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢癌[10]組織中TET1表達明顯下調。此外，TET1還參與結直腸癌的發生、發展[11]。目前，DJ-1和TET1在宮頸癌中的作用還尚未明確。因此，本研究探討宮頸癌患者DJ-1和TET1的表達水平與宮頸癌發生、發展的關系，為進一步尋找宮頸癌早期診斷的生物標志物和治療相關靶點提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1-9月貴州醫科大學附屬醫院婦科診治的40例宮頸疾病患者為研究對象。納入標準：(1)子宮肌瘤經婦科和B超確診[12]，宮頸癌及宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)參照《中國子宮頸癌篩查及異常管理相關問題專家共識》[13]標準并結合病史、細胞學檢查、病理活檢結果確診；(2)患者入院前未接受化療、放療及激素治療，同時也未服用過其他類型的藥物。排除標準:(1)合并傳染性疾病；(2)合并自身免疫性疾病；(3)繼發性盆腔癌，或合并乳腺、 肝、腎、肺等其他臟器惡性腫瘤；(4)入院前半年接受免疫抑制劑治療。40例患者按照檢查結果分為宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級組和子宮肌瘤組。其中宮頸癌Ⅰ組15例，年齡38～70歲，平均(50.60±3.49)歲；CINⅢ級組15例，年齡28～59歲，平均(42.80±9.45)歲；子宮肌瘤組10例，年齡43～54歲，平均(47.10±2.92)歲。3組年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。另選取2020年6-8月行婦科手術切除的10例宮頸癌患者作為宮頸癌Ⅱ組，并以其癌旁組織作為癌旁對照組，患者年齡38～62歲，平均(47.00±8.15)歲。本研究所有研究對象知情同意，且經醫院醫學倫理委員會審核批準(倫理批件號：2018倫審第075號)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學

宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級組、子宮肌瘤組組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，水化，檸檬酸鈉抗原修復液修復3 min，3%過氧化氫30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，山羊血清封閉30 min，滴加DJ-1抗體(1∶1 000)，濕盒4 ℃過夜，次日取出，平衡至室溫30 min，棄去一抗，PBS洗3次，每次10 min，滴加酶標山羊抗兔IgG聚合物，室溫放置2 h；棄掉二抗，PBS洗3次，每次10 min；DAB顯色，顯色時間為3～5 min，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，返藍，脫水透明，封片。用已知宮頸癌的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。根據組織切片著色的陽性細胞數和著色面積進行評分，挑選5個高倍鏡視野(×400)觀察，采用二級計分法進行結果判斷，染色強度評分標準為：未著色，陰性，0分；著色呈淺黃色，弱陽性，1分；著色呈黃色或深黃色，中度陽性，2分；著色較強呈黃褐色，強陽性，3分。染色面積評分標準為：無陽性細胞，0分；陽性細胞計數小于25%，1分；陽性細胞計數占25%～50%，2分；陽性細胞計數大于50%，3分。免疫組織化學著色評分=染色強度評分×染色面積評分，0分記為“-”，表示陰性；1～2分記為“+”，表示弱陽性；3～4分記為“++”，表示中陽性；≥5分記為“+++”，表示強陽性。為方便統計，本研究將“-”“+”定為陰性,“++”“+++”定為陽性[14]。

1.2.2細胞培養

人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic(北京北納創聯生物技術研究院)、宮頸癌細胞SiHa和HeLa(南京科佰生物科技有限公司)均用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基，置于37 ℃，CO2體積分數為5%，濕度為97%的培養箱中培養，每2～3天更換1次新鮮培養基，待細胞融合度達80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.2.3Western blot

稱取宮頸癌Ⅱ組和癌旁對照組組織各50～80 mg，剪碎，在液氮中充分研磨，或將對數生長期的HcerEpic、SiHa和HeLa細胞以每孔1×105個接種于6孔板中，培養24 h后，收集細胞，加入約100 μL RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min后取上清液,測定蛋白濃度。配制5%濃縮膠和12%或8%的分離膠,每泳道加總蛋白量25 μg進行電泳分離；恒壓80 V，30 min，后轉120 V至當樣品中的溴酚藍移動至膠底邊上時，即可結束電泳。將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,在含5%脫脂奶粉溶液中常溫封閉2 h，分別加入兔抗人DJ-1單克隆抗體(1∶10 000)、兔抗人TET1多克隆抗體(1∶1 500)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，每次10 min，共3次，后加入辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，每次10 min，共3次。電化學發光(ECL)進行顯影，GAPDH作為內參，采用Image J圖像分析軟件,分別用DJ-1和TET1與GAPDH灰度比值表示DJ-1和TET1蛋白相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 不同宮頸組織DJ-1表達情況比較

DJ-1主要在細胞質表達，部分細胞核也有表達，呈棕色。DJ-1在子宮肌瘤組[2/10(20%)]、CINⅢ級組[9/15(60%)]和宮頸癌Ⅰ組[12/15(80%)]陽性表達率逐漸升高，3組比較差異有統計學意義(χ2=8.091，P=0.004)，見圖1。

A：子宮肌瘤組；B：CINⅢ級組；C：宮頸癌Ⅰ組。

2.2 宮頸癌及癌旁正常組織DJ-1和TET1表達情況

Western blot結果顯示，與癌旁對照組比較，宮頸癌Ⅱ組DJ-1表達水平升高，TET1表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 宮頸癌及癌旁正常組織DJ-1和TET1表達情況

2.3 不同宮頸細胞DJ-1和TET1表達情況

Western blot結果顯示，與人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic比較，宮頸癌細胞SiHa和HeLa的DJ-1表達水平升高，TET1表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4、5。

a：P<0.05，與癌旁對照組比較。

a：P<0.05，與HcerEpic比較。

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其治療手段有限，手術、放化療等對早期的宮頸癌來說還尚有效，但對于晚期宮頸癌來說，療效及預后較差。對此，尋找更為有效的、針對性的早期診斷與治療靶點就顯得尤為重要。

DJ-1主要存在于細胞質，也可存在于細胞核，與線粒體功能密切相關[15]。目前發現體內野生型DJ-1以二聚體形式參與人體中多種病理生理過程的調控，其中包括細胞轉化、抗凋亡、抗氧化應激、分子伴侶活性及負性調節等，這些調控功能均可能在促進腫瘤的發生、發展中具有重要意義[16]。在原發性非小細胞肺癌組織中，DJ-1的表達高于正常細胞，并發現DJ-1高表達與患者預后和復發風險相關[17]。多項研究表明DJ-1與結直腸癌的發生、發展密切相關，可通過多種途徑調節腫瘤生長、侵襲、促進細胞存活及增殖等[18-20]。

本研究采用免疫組織化學法檢測宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級組和子宮肌瘤組DJ-1的表達情況，結果表明，DJ-1陽性表達率隨著宮頸病變嚴重程度的增加而逐漸升高，提示DJ-1與宮頸癌的發生、發展相關。為了進一步了解DJ-1在宮頸癌組織中的表達水平，本研究采用Western blot檢測DJ-1在宮頸癌細胞SiHa、HeLa及宮頸癌Ⅱ組的表達水平，結果顯示DJ-1在宮頸癌組織中的表達水平升高，這與WANG等[21]研究結果一致。

表觀遺傳學是指在不改變核苷酸序列的前提下染色體所發生的、可以遺傳給后代的變化。而DNA甲基化是迄今為止哺乳動物研究最多的表觀遺傳修飾之一，它的異常表現與多種疾病的發生、發展密切相關。TET1是TET蛋白家族的主要成員之一，是新發現的一種基因甲基化調節酶。文獻報道在許多實體瘤的研究中，發現與癌旁組織比較，腫瘤組織中TET1的表達水平明顯減少，且還伴隨著5-hmC的表達降低及異常DNA甲基化積累，表明在腫瘤的發生、發展中，TET1具有重要作用。研究報道在卵巢癌組織中，TET1的表達與臨床分期呈負相關關系[22]。此外，文獻報道TET1可因自身被甲基化而表達沉默，促進腫瘤的發展，表明TET1自身也具有抑癌基因的作用[23]。還有研究發現，TET1可抑制乳腺癌細胞的增殖和轉移能力[24]，但在宮頸癌研究中少有報道。本研究用Western blot檢測宮頸癌細胞SiHa、HeLa及宮頸癌Ⅱ組TET1的表達情況，發現TET1在宮頸癌中的相對表達水平降低，提示TET1可能與宮頸癌的發生有關。

綜上所述，DJ-1和TET1在宮頸癌的異常表達可能與其發生、發展相關，但由于本研究樣本量較小，未對腫瘤患者臨床病理特征做相關性分析，需加大樣本量進一步證實。此外，DJ-1和TET1之間是否存在相互作用的途徑，下調DJ-1或上調TET1表達在宮頸癌發生、發展過程中的影響還有待進一步研究，而這一機制的闡明可為宮頸癌的早期診斷、干預和靶向治療提供試驗依據。