冠心病患者血清lncRNA CHAST的表達和臨床意義

曾偉雄,曾金財,方快發

(廣東省惠州市第六人民醫院心內科 516200)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是影響人類健康的頭號殺手[1-2]。如不及時診斷和治療，病情會逐步進展導致治療難度增大，死亡風險增加，部分患者極易發生猝死[3-4]。冠狀動脈造影是目前臨床診斷冠心病的金標準，但其屬于有創檢測，且對冠心病早期診斷和病情嚴重程度評估價值不足，患者接受度不高，因此存在一定局限性[5-6]。

最近研究發現長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)參與動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓等心血管疾病的發生和進展過程，其在循環中可穩定存在并可被檢測[7-10]。lncRNA CHAST屬于最新鑒定的lncRNA之一，研究顯示其參與心力衰竭后左心室的重構過程，參與冠心病患者缺血缺氧心肌細胞應激反應過程，可望成為參與冠心病發病過程的關鍵lncRNA分子[11-12]。絲氨酸蛋白酶抑制劑A3(serpina3)又稱作α-1抗糜蛋白酶，最先鑒定為急性期血漿蛋白酶抑制劑[13]，其在先兆子癇患者循環中水平明顯增加，可能與慢性炎癥和孕婦血管內皮細胞損傷密切相關[14]。最近研究顯示serpina3是主動脈鈣化的早期診斷標志物[15]。盡管如此，目前尚無研究探討冠心病患者血清serpina3水平及其臨床意義。本研究探討冠心病患者循環中lncRNA CHAST和serpina3水平并分析其對冠心病的臨床診斷及在預后評估中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2019年7月本院心內科收治的115例冠心病患者作為研究對象。納入標準[6]：(1)符合2020國際心臟病學會和世界衛生組織(WHO)對冠心病的診斷標準；(2)均行冠狀動脈造影檢查，至少1支冠狀動脈血管狹窄程度大于或等于50%；(3)不存在其他部位癌癥或血液系統惡性疾病；(4)臨床病歷資料完整。排除標準：(1)嚴重的肝、腎、肺等臟器功能障礙者；(2)合并惡性血液系統疾病或嚴重免疫系統疾病需要長期藥物治療者；(3)嚴重精神疾病或存在溝通障礙；(4)既往有冠心病且接受過內科血管重建或外科冠狀動脈旁路移植術者；(5)孕婦和哺乳期婦女。115例冠心病患者作為冠心病組，其中男65例，女50例，年齡44～72歲，平均(59.22±6.39)歲；疾病類型：穩定型心絞痛66例，不穩定型心絞痛34例，急性心肌梗死15例；單支、2支和多支血管病變分別有47、33和35例。從同期本院體檢科常規健康體檢人員中選取年齡和性別相匹配的健康體檢者65例為對照組，其中男43例，女22例，年齡44～73歲，平均(57.20±7.23)歲。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1分組

根據冠狀動脈造影結果所得的Gensini評分對冠心病組進行亞組分組。Gensini評分標準[16]：冠狀動脈無狹窄為0分，冠狀動脈狹窄程度在0～<26%為1分，26%～<51%為2分，51%～<76%為4分，76%～<91%為8分，91%～<100%為16分，而冠狀動脈狹窄100%為32分。冠心病患者最終Gensini評分為每例患者的各個分支積分相加。Gensini評分0～25分為輕度病變組，26～49分為中度病變組，≥50分為重度病變組，115例冠心病患者中，輕度病變組32例、中度病變組45例、重度病變組38例。

1.2.2臨床標本收集

兩組入選的研究對象均采集清晨空腹靜脈血，采血時保持平臥位，采集患者外周上肢靜脈血8 mL,3 000 r/min在5 ℃離心15 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存待統一檢測。

1.2.3循環血清lncRNA CHAST表達水平檢測

實時熒光定量PCR檢測兩組循環血清lncRNA CHAST表達水平：按血清/血漿miRNA提取分離試劑盒說明書(德國Qiagen公司)進行RNA提取后檢測RNA純度，選擇吸光度1.8～2.1的合格RNA標本,使用QuantiTect逆轉錄試劑盒(德國Qiagen公司)，從1 μg總RNA中合成cDNA，并將標本保存于-20 ℃冰箱中。采用RealQ Plus 2x Master Mix for Probe(無ROXTM)進行3次重復實時熒光定量PCR檢測。反應在Rotor-Gene Q(德國Qiagen公司)上進行,lncRNA CHAST正向引物為5′-TGC TGC ACT TTA CAA CCA CTG-3′,反向引物為5′-ATG GTG TCT TTG ATG TTG GGC-3′,PCR反應參數如下：95 ℃預變性15 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，40個循環。于60 ℃時采集熒光信號，以U6為內參基因。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA CHAST相對表達水平，每份標本均連續測定3次，取平均值。

1.2.4血清serpina3水平檢測

采用ELISA檢測血清serpina3水平，試劑盒購自北京優爾生科技公司，嚴格按照試劑盒說明書操作，所有標本統一檢測，最小的檢測水平為0.01 μg/mL，組間和組內的變異系數分別為3.5%和5.0%。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較

冠心病組循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較

2.2 不同嚴重程度冠心病組血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較

輕、中、重度病變組血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較，差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

2.3 lncRNA CHAST、serpina3與Gensini評分的相關性分析

Pearson相關性分析示：lncRNA CHAST與Gensini評分呈正相關(r=0.783，P<0.05)，serpina3與Gensini評分呈正相關(r=0.726，P<0.05)，lncRNA CHAST與serpina3也呈正相關(r=0.901，P<0.05)，見圖1。

表2 不同嚴重程度冠心病組血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平比較

A：lncRNA CHAST與Gensini評分的相關性；B：serpina3與Gensini評分的相關性；C：lncRNA CHAST與serpina3的相關性。

2.4 lncRNA CHAST、serpina3對冠心病的診斷價值分析

ROC曲線分析顯示，當lncRNA CHAST的最佳截斷值為0.92時，曲線下面積(AUC)為0.801(95%CI：0.765～0.847，P<0.001),靈敏度為75.1%，特異度為87.9%。當serpina3的最佳截斷值為99.37 μg/mL時，AUC為0.914(95%CI：0.876～0.946，P<0.001),靈敏度為87.1%，特異度為93.9%。二者聯合診斷冠心病的AUC為0.946(95%CI：0.897～0.982,P<0.001),靈敏度為91.1%，特異度為97.9%，見圖2。

圖2 lncRNA CHAST、serpina3對冠心病診斷的ROC曲線

3 討 論

近年來我國冠心病發病率和病死率均逐年上升，且發病年齡更趨于年輕化[17]。鑒于我國人口基數巨大，研究顯示每年因冠心病死亡的人數高達700萬人，給家庭和社會造成巨大的負擔[18]。如何早期有效對冠心病患者進行診斷，并對其病情進展進行有效監測顯得尤為重要，是降低患者潛在血管事件發生及改善預后的重要途徑[18]。

lncRNA可通過調控多種細胞的增殖、凋亡、損傷、自噬[19]和分化等過程[20],進而在心血管疾病的發生、發展過程中發揮重要作用[21]。lncRNA CHAST定位在人類染色體7q32.2上，以細胞溶質﹑核可溶物和染色質相關形式廣泛存在[22]。也可被激活的T細胞信號的核因子所激活。缺血再灌注損傷和永久性梗死后，心肌細胞中活化T細胞核因子的核易位增加[11]。本研究顯示冠心病患者血清lncRNA CHAST表達水平明顯高于對照組，其表達水平在不同嚴重程度的冠心病患者中存在明顯差異，且隨著疾病的進展，表達水平呈增加的趨勢。有研究報道，在急性心肌梗死患者血清lncRNA CHAST表達水平較對照組明顯增加，特別是在心肌梗死早期改變最為明顯[12]，提示可能和心肌缺血密切相關，其水平和心肌梗死患者左心室射血分數呈正相關，在心肌梗死的恢復期，其表達水平逐步下降。盡管冠心病患者血清lncRNA CHAST表達水平增加的機制尚不清楚，推測可能為冠心病的心肌細胞在缺血缺氧刺激下導致其表達水平增高。

serpina3是位于14q32上編碼的約為3.0×109的蛋白質，是由人體肝、心、肺和腎臟組織和細胞合成的急性期蛋白[23]。有研究顯示其可參與慢性阻塞性肺疾病、帕金森病、腦出血和多發性系統性萎縮疾病的發展[24]。有研究報道在動脈粥樣硬化病變中，serpina3水平增加，在輕度卒中或短暫性腦缺血發作的患者中serpina3水平增加更為明顯[25]。本研究顯示冠心病患者血清serpina3水平高于對照組，隨著冠心病患者Gensini評分增加，serpina3水平明顯增加，在不同嚴重程度的冠心病患者中存在明顯差異，提示其可作為評估冠心病患者病情嚴重程度的有效指標。文獻報道顯示，與對照組比較，急性心肌梗死患者基礎血漿serpina3水平升高[26]。急性心肌梗死后激活的嗜中性白細胞和肥大細胞衍生蛋白，產生炎性因子瀑布效應，可能調節心肌細胞對于serpina3的表達[26]。在心肌梗死的血管平滑肌細胞中serpina3水平也明顯增加，其可能是在冠心病患者的缺血心肌細胞和供應心臟血供的微循環中，血管平滑肌細胞serpina3水平增加導致冠心病患者血清循環的serpina3水平增加[27]。

本研究發現隨著冠心病嚴重程度增加，冠狀動脈造影所得的Gensini評分增加[28]，發現冠心病患者循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平也逐漸增加，Gensini評分增加和循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平呈正相關，同時冠心病循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平也呈正相關，上述結果顯示冠心病循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平可作為評價冠心病嚴重程度的潛在的生物標志物，臨床上可通過檢測循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3濃度來評估冠心病的嚴重程度。

ROC曲線分析顯示通過檢測循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3濃度均能夠很好地區分是否為冠心病患者，二者診斷冠心病患者的ROC曲線的AUC值分別為0.801和0.914，而兩者聯合檢測的ROC曲線AUC值可達0.946，上述結果提示循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3濃度對冠心病具有較好的診斷效能，其相對于冠心病其他診斷手段如冠狀動脈造影，具有無創的優勢。

綜上所述，冠心病患者循環血清lncRNA CHAST表達水平和serpina3濃度均明顯高于健康對照人群，單獨和聯合檢測lncRNA CHAST表達水平和serpina3水平可對冠心病進行早期診斷和病情嚴重程度評估，二者可能成為冠心病患者潛在的無創生物標志物。