基于網絡藥理學分析蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的作用機制

江國華，譚燕平，陳宣睿，陳嘉南，徐鴻棋，朱 晟，伍遠平，陳躍洲

（1.廣州中醫藥大學深圳臨床醫學院，廣東 深圳 518172；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510006）

糖尿病足潰瘍是指糖尿病患者因肢端神經血管異常而繼發的足部感染或潰瘍。糖尿病足潰瘍是導致糖尿病患者截肢、死亡的重要因素[1]。糖尿病足潰瘍在中醫學中屬于“脫疽”、“消渴”等范疇，中醫認為濕熱與毒瘀是此病的主要致病因素[2]。近年來，中醫在糖尿病足潰瘍的治療中逐漸得到應用，并取得了較好的效果[3]。中藥蚓黃散由黃柏、地龍、血竭三味中藥組成，具有清熱、解毒、利濕的功效，能促進糖尿病足潰瘍患者創面的愈合，降低其截肢的發生率[4]。相關的研究表明，清熱解毒類中藥可改善血清晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products AGEs）、腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性因子的水平，延緩糖尿病足潰瘍的進展[5]。蚓黃散作為清熱解毒類中藥制劑，對糖尿病足潰瘍的治療效果已得到臨床證實，但其確切的作用機制尚不清楚[6]。網絡藥理學是基于系統生物學理論，對生物系統進行網絡分析，選取特定的信號節點進行多靶點藥物分子設計的新學科。該學科可從整體出發，針對中藥制劑的配伍、作用規律等進行不同層次的網絡篩選，構建多成分、多靶點、多途徑的分子機制，現已成為中藥復方研究的新方法[7-9]。本研究基于網絡藥理學方法，構建“成分-靶點-信號通路”多維網絡，探究應用蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的作用機制，為蚓黃散的臨床應用提供一定的理論依據。

1 資料和方法

1.1 蚓黃散藥物活性成分的篩選

通過中藥系統藥理分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）并結合其他數據庫的文獻，獲得蚓黃散的全部化學成分，設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類 藥 性（Drug-Likeness，DL）≥0.18為篩選條件[10-11]，確定候選化合物，并利用Uniprot數據庫（https://www. uniprot.org）規范其靶點名稱。

1.2 糖尿病足潰瘍疾病靶點的篩選

通 過GeneCards數 據 庫（https://www.genecards.org）和OMIM數據庫（https://www.omim.org/）以“Diabetic foot ulcer”為關鍵詞檢索出與糖尿病足潰瘍相關的基因。

1.3 構建蚓黃散成分-靶點網絡

利用Cytoscape 3.7.2軟件構建蚓黃散成分-靶點網絡圖，并分析成分與靶蛋白之間的相關性。

1.4 構建蛋白質-蛋白質相互作用（proteinproteininteraction，PPI）網絡圖

將上述預測的可能靶標輸入STRING 10.5數據庫（https://string-db.org），獲取蛋白質相互作用信息，并得出PPI網絡圖。

1.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

應用David數據庫（https://david.ncifcrf.gov）分別進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析。

1.6 構建成分-靶點-信號通路網絡圖

利用Cytoscape 3.7.2軟件合并蚓黃散與靶點蛋白的相關信息、信號通路與靶點蛋白的相關信息，構建成分-靶點-信號通路網絡圖。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選結果

利用TCMSP平臺檢索出蚓黃散中的黃柏含有140種活性成分，通過其他數據庫檢索出蚓黃散中的血竭含有10種活性成分，地龍含有3種活性成分。以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件進行篩選，最終篩選出50個候選化合物。

2.2 成分-靶點網絡圖

在Cytoscape 3.7.2軟件中利用蚓黃散篩選出的成分與靶點信息，構建蚓黃散成分-靶點網絡圖（詳見圖1）。圖1中有136個節點和1018條邊，包括30個化合物節點（綠色）、106個靶節點（藍色）。化合物的度值越高，則其在網絡中節點對應的邊越多，在網絡中起越關鍵的作用。在蚓黃散的成分-靶點網絡中，度值靠前的化合物分別為槲皮素（quercetin）、異紫堇杷明（Isocorypalmine）、氫化小檗堿〔(S)-Canadine〕、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol），其對應的靶點數分別為70、37、35、33、33。由此可見，槲皮素、異紫堇杷明、氫化小檗堿、β-谷甾醇、豆甾醇可能是蚓黃散發揮藥效的主要成分。度值靠前的靶點分別為AR、ESR1、PPARG、NOS2，這些靶點可能是蚓黃散發揮藥效的主要靶點。

圖1 蚓黃散的成分-靶點網絡

2.3 蚓黃散與糖尿病足潰瘍的交集靶點

利用TCMSP共查詢出蚓黃散預測效靶106個，同時從Genecards數據庫和OMIM數據庫收集糖尿病足潰瘍的相關靶點2398個，將二者取交集后得到應用蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的可能靶標76個。詳見圖2。

圖2 蚓黃散與糖尿病足潰瘍交集基因的維恩圖

2.4 蚓黃散與糖尿病足潰瘍交集的PPI網絡

在STRING 10.5數據庫中對上述76個交集蛋白進行蛋白質-蛋白質相互作用分析，得到圖3。圖3中有76個節點、1310條邊，平均度值為17.24。其中各節點表示作用靶點，靶點之間的彼此關系用邊表示，邊數越多表明該節點對應的作用靶點越重要。由度值得出主要作用靶點的信息條形圖（詳見圖4）。由圖4可知，白細胞介素-6（IL-6）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、JUN基因、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、IL-1β排序靠前，在PPI網絡中起著重要的聯系作用，可能是關鍵的作用靶點。

圖3 蚓黃散與糖尿病足潰瘍交集的PPI圖

圖4 互作關系排名靠前的相關靶標

2.5 基因功能和通路分析結果

應用David數據庫分別進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析（詳見圖5、圖6）。在KEGG通路富集分析中排名靠前且與糖尿病足潰瘍聯系密切的通路包括PI3KAkt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥相關通路（Pathways in cancer）、TNF信 號 通 路（TNF signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）等。

圖5 蚓黃散靶標的GO功能富集分析

圖6 用蚓黃散治療糖尿病足潰瘍相關靶蛋白的KEGG通路富集分析

2.6 成分-靶點-信號通路

蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的藥物活性成分-靶點-信號通路詳見圖7。圖7中含30個化合物節點（綠色）、76個靶節點（藍色）及20個通路（紫色），篩選出的蚓黃散藥物活性成分可通過作用于多個靶點而調控多條信號通路，從而協同發揮治療糖尿病足潰瘍的作用。

圖7 蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的藥物活性成分-靶點-信號通路圖

3 討論

糖尿病足潰瘍創面愈合的過程由多種細胞因子、炎性因子共同參與。研究發現，炎癥反應的發生發展與糖尿病足潰瘍創面的愈合程度密切相關[12]。李友山等[13]研究指出，炎癥反應始終貫穿糖尿病足潰瘍的病理過程，這與祖國醫學中“濕熱與毒瘀”的致病特點極為相似，而蚓黃散具有明顯的抗炎作用，可用于治療糖尿病足潰瘍。進一步發掘并分析蚓黃散潛在的藥理機制，對應用此藥治療糖尿病足潰瘍具有重要的意義。本研究通過進行網絡藥理學研究表明，蚓黃散中的藥物活性成分主要為槲皮素、異紫堇杷明、氫化小檗堿、β-谷甾醇、豆甾醇等。有報道稱，槲皮素可通過下調TNF-α、IL-1等炎性因子的表達及下調PI3K-Akt信號通路而抑制炎癥反應[14]。本研究通過分析交集蛋白的PPI網絡發現，蚓黃散中的有效成分可能是通過作用于IL-6、VEGFA、JUN基因、PTGS2、EGF、IL-1β等靶點而起作用。IL-6、IL-1β、PTGS2主要參與機體的各種炎癥反應[15-16]。VEGFA在血管形成中起到重要的作用，糖尿病足潰瘍患者因血管內皮功能遭到破壞，故可導致其血清VEGFA的水平下降[17]。本研究通過進行KEGG通路富集分析發現，蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的作用機制主要涉及PI3K-Akt信號通路、癌癥相關通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路等。本研究發現，IL-6、PTGS2、VEGFA主要在PI3K-Akt信號通路上富集，而PI3K-Akt信號通路在內皮細胞增殖的過程中發揮著關鍵作用。有研究指出，蚓黃散中的黃柏在抑制TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的過程中也可使環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）失活，其抗炎作用與下調PI3K-Akt信號通路極為相似[18-19]。這表明，應用蚓黃散治療糖尿病足潰瘍是通過多生物途徑、多信號通路共同起作用的。

綜上所述，蚓黃散可通過多成分、多靶點、多信號通路協同治療糖尿病足潰瘍。但本研究僅通過生物信息學手段對蚓黃散治療糖尿病足潰瘍的機制進行初步分析，存在一定的局限性，日后需對蚓黃散可能存在的治療靶點、作用通路等加以驗證。