黨參米炒前后醇溶性浸出物、黨參炔苷測定及其健脾止瀉作用對比

帖曉燕，馮銀平，張云鶴，楊錫倉，李 蕓*，胡芳弟

（1.甘肅中醫藥大學，甘肅蘭州730000； 2.蘭州大學，甘肅蘭州730000； 3.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000）

黨參為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花黨參C.pilosula Nannf.var.Modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參C.tangshenOliv.的干燥根［1］，具健脾益肺、養血生津之功效。黨參氣味甘、平，生用長于益氣生津、氣血雙補，米炒后氣變清香，和胃、健脾止瀉作用增強，用于脾胃虛弱，食少，便溏等，清·《時病論》 曰“黨參……米炒，治脾土虛寒泄瀉”［2］。目前，黨參米炒健脾止瀉物質基礎尚不清楚。黨參主要含有有多炔類、苯丙素類、三萜類、糖類、生物堿類等多種成分，現代藥理研究表明，黨參具有免疫調節、抗菌、抗腫瘤、抗潰瘍等藥理作用［3?4］。黨參炔苷為黨參的主要活性成分之一，為聚乙炔類化合物，對乙醇造成的胃黏膜損傷有很好的保護作用，具有明顯的抗潰瘍作用［5］。目前，黨參炔苷還沒有成為《中國藥典》 作為黨參質量控制的主要指標，有望將來能實現。

本實驗以渭源會川產的黨參（白條黨）為研究對象，通過熱浸法、HPLC 法研究黨參米炒前后醇溶性浸出物、黨參炔苷含量的變化，以番瀉葉瀉下和番瀉葉加勞倦過度2 種方法復制小鼠脾虛泄瀉模型，對比研究黨參米炒前后健脾止瀉藥效變化，進一步證實黨參米炒后健脾止瀉作用增強的科學、合理性，初步探討基于黨參炔苷炮制前后變化闡述健脾止瀉功效變化之炮制機制，以期為臨床選用恰當的炮制品提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑 黨參采自甘肅省渭源縣會川鎮，經甘肅中醫藥大學附屬醫院楊錫倉主任中藥師鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根。黨參炔苷對照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號CHB150815，HPLC≥98.00%）。蒙脫石散（山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，批號1803004）。番瀉葉（甘肅中醫藥大學附屬醫院）；淀粉酶（AMS）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）。乙腈、甲醇均為色譜純；45%乙醇為分析純，水為純凈水。

1.2 動物 SPF 級昆明小鼠，體質量18～22 g，雌雄各半，由中國農業科學研究院蘭州獸醫研究所實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號SCXK（甘）2015?0001。

1.3 儀器 Agilent 1100 Series 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；DAD 檢測器UV?3300（上海美譜達儀器有限公司）；KQ?500DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW?400A 高建萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）；SHB?ⅢA 循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；BT125D 型電子天平（1∕10 萬，美國賽多利斯科學儀器有限公司）；DHG?9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；HHS?11S 數顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；BC?2800Vet 型獸用全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）。

2 方法

2.1 黨參的炮制

2.1.1 生品 將藥材去除雜質，洗凈，泡15～20 min（水沒過藥面），悶潤3 h，切制成2～4 mm 的厚片，于50 ℃下干燥［6］，取出備用，炮制3 批。

2.1.2 米炒品 取藥材飲片，用米拌炒至表面深黃色，取出，篩去米，放涼（每100 kg 黨參用大米20 kg）備用［1］，炮制3 批，得率85.2%，該過程由“隴原工匠”楊錫倉老師指導完成。

2.2 黨參米炒前后浸出物測定 取生品、米炒品粉末（過3 號篩）各約2.0 g，精密稱定，按照2020 年版《中國藥典》 四部（通則2201），加45%乙醇，以熱浸法進行測定，每批樣品平行3 份。

2.3 黨參米炒前后黨參炔苷含量測定

2.3.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（22 ∶78）；體積流量1.0 mL∕min；檢測波長269 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 黨參炔苷HPLC 色譜圖

2.3.2 對照品貯備液制備 取黨參炔苷對照品2.90 mg，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.29 mg 的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液制備 取生品、米炒品粉末（過3 號篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲（250 W，33 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 線性關系考察 精密吸取對照品貯備液0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 mL，置5 mL 量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，制成質量濃度為14.5、29.0、58.0、87.0、116.0、145.0 μg∕mL 的系列工作溶液，連同貯備液在“2.3.1”項色譜條件下進樣，記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積值為縱坐標（Y）進行回歸。

2.3.4.2 精密度試驗 量取對照品貯備液，在“2.3.1”項色譜條件下重復進樣6 次，依法測定。

2.3.4.3 重復性試驗 取樣品（第2 批），按“2.3.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下測定。

2.3.4.4 穩定性試驗 取樣品（第2 批）溶液，于0、2、4、6、8、12、24、72 h 在“2.3.1”項色譜條件下測定。

2.3.4.5 加樣回收率試驗 取1.0 g 成分含量已知（1.15 mg∕g）的樣品（第2 批）6 份，精密稱 定，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，并精密加入已知質量濃度的黨參炔苷對照品溶液各4 mL，在“2.3.1”項色譜條件下測定，計算回收率。

2.3.4.6 樣品含量測定 分別精密稱取生品、米炒品各3批，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下測定，計算含量。

2.4 黨參米炒前后脾虛泄瀉小鼠的藥效對比

2.4.1 番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠模型的復制 將KM 小鼠隨機分為空白組，模型組，陽性組，黨參和米炒黨參高、中、低劑量組，每組6 只。除空白組外，其余各組采用苦寒瀉下法復制脾虛泄瀉模型［7］，具體方法為造模組小鼠灌胃給予12%番瀉葉水煎液0.5 mL∕只，每日1 次，連續10 d；空白組常規飼養。

模型復制成功后，陽性組灌胃給予1.17 g∕kg 的蒙脫石散，黨參和米炒黨參高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予15.6、7.8、3.9 g∕kg 相應劑量水提物，空白組和模型組小鼠灌胃給予等劑量的蒸餾水，每日1 次，連續6 d。給藥期間除空白組外，其余各組持續造模。

2.4.2 番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠模型的復制 將KM 小鼠隨機分為空白組，模型組，陽性組，黨參和米炒黨參高、中、低劑量組，每組6 只，除空白組外，其余各組采用“苦寒瀉下法＋勞倦過度”復合因素造模方法復制脾虛泄瀉模型［8］，具體方法為造模組小鼠灌胃給予100%番瀉葉水煎液（0.5 mL∕只），并置于（25±1）℃、水深50 cm的游泳缸中負重游泳至力竭，以身體下沉為度，每日1 次，連續7 d；空白組常規飼養。

模型復制成功后，陽性組灌胃給予1.17 g∕kg 的蒙脫石散，黨參和米炒黨參高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予15.6、7.8、3.9 g∕kg 相應劑量水提物，空白組和模型組小鼠灌胃給予等劑量的蒸餾水，每日1 次，連續6 d。給藥期間除空白組外，其余各組持續造模。

2.4.3 血常規檢測 給藥前1 d，小鼠禁食不禁水12 h后，眼眶靜脈叢采血，迅速用全自動血液細胞分析儀檢測血常規。

2.4.4 一般情況觀察 分別觀察各組小鼠造模前后及給藥治療后的一般狀態，包括體質量、進食量、活動情況、精神狀態、大便、是否脫肛等。

2.4.5 小鼠血清AMS、LDH 水平測定 末次給藥24 h 后，小鼠腹腔注射4%水合氯醛（0.2 mL∕20 g）進行麻醉，股動脈取血，靜置30 min 后3 500 r∕min 離心15 min，吸取上層血清，按照實際和說明書要求應用比色法測定AMS、LDH 水平。

2.4.6 小鼠免疫器官胸腺、脾臟指數的測定 記錄末次給藥24 h 后小鼠體質量，脫頸椎處死，取脾臟和胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱定質量，計算脾臟及胸腺指數。臟器指數（mg∕g）＝臟器質量（mg）∕體質量（g）。

2.4.7 統計學處理 運用SPSS 24.0 統計軟件進行統計分析，計量資料以（）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 黨參米炒前后浸出物測定 黨參米炒后，醇溶性浸出物明顯降低，見圖2。

圖2 黨參、米炒黨參醇浸出物測定結果

3.2 方法學考察 黨參炔苷回歸方程為Y＝4 078.4X－5.402 3（r＝0.999 8），在14.5～290.0 μg∕mL 范圍內線性關系良好。精密度試驗中黨參炔苷峰面積RSD 為1.70%，表明儀器精密度良好；重復性試驗中黨參炔苷含量RSD 為1.20%，表明該方法重復性良好；穩定性試驗中黨參炔苷峰面積RSD 為2.66%，表明溶液在72 h 內穩定性良好；平均加樣回收率為103.20%，RSD 為2.48%，見表1。黨參米炒前后黨參炔苷含量基本無變化，見表2。

表1 黨參炔苷加樣回收率試驗結果（n＝6）

表2 黨參炔苷含量測定結果

3.3 對番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠的健脾止瀉作用

3.3.1 對小鼠血常規檢測的影響 本實驗結合血常規中的白細胞數（WBC）、淋巴細胞數（LYMPH）、紅細胞數（RBC）、紅細胞壓積（HCT）、血小板計數（PLT）、血小板壓積（PCT）、血紅蛋白（HGB）等綜合判斷脾虛證小鼠模型是否復制成功。與空白組比較，血小板計數明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 小鼠血常規檢測結果（Ⅰ，， n＝6）

表3 小鼠血常規檢測結果（Ⅰ，， n＝6）

注：與空白組比較，＃P＜0.05。

3.3.2 對小鼠體質量的影響 與空白組比較，模型組小鼠進食量下降，皮毛松散，無光澤，便軟不成形，體質量下降（P＜0.01）；與模型組比較，米炒黨參高、中劑量組小鼠的體質量升高（P＜0.05，P＜0.01），黨參高劑量組有升高的趨勢但沒有統計學差異（P＞0.05）；與同劑量黨參組比較，米炒黨參高劑量組小鼠的體質量升高（P＜0.05）。表明黨參和米炒黨參對番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠體質量有改善作用，且米炒黨參效果更佳，見圖3。

圖3 黨參、米炒黨參水提物對番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠體質量的影響

3.3.3 對小鼠AMS、LDH 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠AMS、LDH 水平顯著降低（均P＜0.01）；與模型組比較，黨參高劑量組和米炒黨參高、中、低劑量組小鼠AMS 水平均升高，米炒黨參高劑量組較明顯（P＜0.01），并能升高LDH 水平（P＜0.01）；與同劑量黨參組比較，米炒黨參高、中、低劑量組小鼠AMS 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），米炒黨參高劑量組小鼠LDH 水平升高（P＜0.05），表明黨參及米炒黨參對番瀉葉致脾虛泄瀉小鼠AMS 和LDH水平均有升高作用，以米炒品更為顯著，見圖4。

3.3.4 對臟器指數的影響 與空白組比較，模型組小鼠脾臟指數、胸腺指數明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組、米炒黨參高劑量組和黨參高劑量組脾臟指數升高（P＜0.05，P＜0.01），黨參中劑量組、米炒黨參高、中劑量組胸腺指數均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與同劑量黨參組比較，米炒黨參高、中、低劑量組脾臟指數升高（P＜0.01），米炒黨參高、低劑量組胸腺指數升高（P＜0.01），表明黨參及米炒黨參對脾虛泄瀉小鼠脾臟及胸腺均有保護作用，以米炒品更佳，見圖4。

3.4 對番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠的健脾止瀉作用

3.4.1 對小鼠血常規檢測的影響 與空白組比較，PLT、PCT 降低（P＜0.05，P＜0.01），表明造模成功，見表4。

表4 小鼠血常規檢測結果（Ⅱ，， n＝6）

表4 小鼠血常規檢測結果（Ⅱ，， n＝6）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4.2 對小鼠體質量的影響 與空白組比較，模型組小鼠進食量下降，畏寒、蜷臥少動，游泳耐力下降，皮毛松散，無光澤，便軟不成形，體質量下降（P＜0.01）；與模型組比較，米炒黨參高、中劑量組小鼠的體質量升高（P＜0.05，P＜0.01），黨參高、中劑量組有升高趨勢但無統計學差異（P＞0.05）；與同劑量黨參組比較，米炒黨參高、中劑量組小鼠的體質量升高（P＜0.05），表明黨參和米炒黨參對番瀉葉瀉下加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠體質量有改善作用，以米炒黨參更佳，見圖5。

圖5 黨參、米炒黨參水提物對番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠體質量的影響

3.4.3 對小鼠AMS、LDH 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠AMS、LDH 水平均降低（均P＜0.01）；與模型組比較，黨參高劑量組和米炒黨參高劑量組小鼠AMS 均升高，以米炒黨參高劑量組更明顯（P＜0.01），并能升高LDH 水平（P＜0.01）；與同劑量黨參組比較，米炒黨參中劑量組小鼠LDH 水平升高（P＜0.05），表明黨參及米炒黨參對番瀉葉瀉下加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠AMS 和LDH 水平均有升高作用，以米炒品更為顯著，見圖6。

圖6 黨參、米炒黨參水提物對番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉小鼠AMS、LDH 活性及臟器指數的影響

3.4.4 對臟器指數的影響 與空白組比較，模型組小鼠脾臟指數、胸腺指數明顯降低（均P＜0.01）；與模型組比較，陽性組和米炒黨參高劑量組脾臟指數升高（P＜0.01），米炒黨參高、中劑量組胸腺指數均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與同劑量黨參組比較，米炒黨參高、中劑量組脾臟指數升高（P＜0.01，P＜0.05），米炒黨參中劑量組胸腺指數升高（P＜0.01），表明黨參及米炒黨參對脾虛泄瀉小鼠脾臟及胸腺均有保護作用，以米炒品更佳，見圖6。

4 討論

米炒黨參是《中國藥典》 收載的黨參的唯一一個炮制品。黨參米炒后醇溶性浸出物明顯降低，推測可能與米炒后黨參所含揮發油及萜類成分部分揮發、部分被米吸附，且該兩類成分均溶于乙醇有關。劉海萍等［9］通過GC?MS 聯用技術對黨參米炒前后揮發性成分進行比較就發現黨參米炒后揮發油含量降低。本實驗結果還表明，黨參米炒前后黨參炔苷含量基本無變化，這可能就是黨參米炒前后均具有補脾氣作用的物質基礎。黨參炔苷對乙醇造成的胃黏膜損傷有很好的保護作用，其抗胃黏膜急性損傷的機制之一可能為提高胃黏膜內前列腺素（PG）的含量，從而對抗胃泌素的泌酸作用，刺激胃黏膜合成釋放表皮生長因子［10］，與黨參補中益氣的傳統功效相符。

本實驗基于單因素和復合因素造模來比較2 種造模方法的優劣，采用番瀉葉瀉下法、番瀉葉瀉下加勞倦過度2種方法復制小鼠脾虛泄瀉模型。本實驗結果顯示，番瀉葉致脾虛泄瀉和番瀉葉加勞倦過度致脾虛泄瀉2 個模型對體重、PCT 及PLT 含量的影響均表現為下降，表明脾虛泄瀉模型復制成功，且番瀉葉加勞倦過度法對造模小鼠體征及血液方面的影響較番瀉葉造模更為明顯，表明造模以復合因素為優。

AMS 是一種重要的消化酶，主要由唾液腺和胰腺分泌，淀粉酶分泌不足，機體的消化功能必然受到影響。LDH 是一種糖酵解酶，是消耗的葡萄糖是否通過需氧或無氧糖酵解轉化為能量的重要決定因素［11］。本研究發現脾虛泄瀉可致血清中AMS、LDH 水平降低，提示脾虛泄瀉可伴有AMS、LDH 分泌異常，米炒黨參治療后對AMS、LDH 分泌有逆轉作用，這表明其對脾虛泄瀉證的治療作用之一可能是通過影響血液中的AMS、LDH 水平實現的。

臟器指數是衡量機體免疫功能的初步指標，脾臟及胸腺指數的改變可直觀反映機體及細胞免疫水平的變化。本研究結果顯示，米炒黨參能顯著增加脾虛泄瀉小鼠的脾臟及胸腺指數，對機體有很好的免疫保護作用，且黨參多糖是增強機體免疫能力的主要生物活性成分［12］，黨參中的免疫活性成分可能通過調控腫瘤壞死因子（TNF）、轉錄因子p65（RELA）、白細胞介素?10（IL?10）、白細胞介素?6（IL?6）等靶點，T 細胞受體信號通路，NOD 樣受體信號通路等多個途徑發揮增強機體免疫功能的作用［13］。

綜上，本實驗結果表明黨參及米炒黨參可升高脾虛泄瀉小鼠AMS、LDH、脾臟和胸腺指數水平，從而減輕脾虛泄瀉癥狀，且米炒黨參健脾止瀉作用更為顯著，推測其功效增強的原因可能為黨參米炒后得率為85%，按照“齊同對比”原則，同等劑量的黨參和米炒黨參藥效對比，米炒黨參組的給藥量相對黨參而言增加15%，因此藥效有增強趨勢；輔料大米氣味甘、平，具補中益氣、健脾和胃、止瀉痢等功效，與黨參共炒后，氣變清香，醒脾開胃作用增強；黨參米炒后，產生了與健脾止瀉作用相關的化學成分，具體變化有望在后續采用LC?MS 進一步研究。

致謝：衷心感謝閆治攀主管中藥師，燕玉奎師兄、馬駿、周尚儒、姚懿芹在實驗期間給予的幫助。