王不留行對脂多糖和H2 O2誘導RAW264.7 細胞炎性反應和氧化反應的影響

袁德俊，吳康郁，黃曉冰

（廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378）

王不留行為石竹科植物麥藍菜Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke 的干燥成熟種子，別名奶米、王不留、麥藍子、剪金子、留行子，是我國傳統(tǒng)常用中藥，性味苦，平，歸肝、胃經(jīng)。具有活血通經(jīng)，下乳消腫，利尿通淋功能，用于乳汁不下、經(jīng)閉、痛經(jīng)、乳癰腫痛等癥［1］。現(xiàn)代藥理學研究表明王不留行具有廣泛的藥理學作用，包括抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抑制血管生成等藥理作用［2］。

目前王不留行抗炎活性研究較少。因此開展中藥王不留行相關(guān)藥效活性研究，有助于王不留行的發(fā)展與利用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW264.7 巨噬細胞是經(jīng)典體外炎癥模型，常用于研究藥物抗炎活性；過氧化氫（H2O2）可以造成細胞氧化損傷。本實驗將以LPS 刺激RAW264.7 巨噬細胞作為研究載體，通過測定相關(guān)炎性因子，探討王不留行抗炎藥效活性；以H2O2造成RAW264.7 巨噬細胞氧化損傷，探討王不留行抗氧化活性。本實驗將為王不留行抗炎抗氧化作用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物和試劑 RPMI?1640 培養(yǎng)基（批號＃8113920）、胎牛血清（批號＃42A0378K）、青霉素（批號＃J160035）均購買于美國 Gibco 公司；脂多糖（LPS，批號＃019M4009V）、二甲基亞砜（DMSO，貨號D2650）為美國Sigma 公司；MTT（貨號G4000，美國Progema 公司）；PBS（貨號ST447）、一氧化氮（NO，貨號S0021S）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠TNF?α（貨號ml002095）、IL?1β（貨號 ml063132）、IL?6（貨號ml002293）、PGE2（貨號 ml037542）、COX?2（貨號ml057994）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；SOD（貨號A001?3?2）、CAT（貨號A007?1?1）、GSH?PX（貨號A005?1?2）、MDA（貨號A003?4?1）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。王不留行來源于嶺南中藥飲片有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院吳康郁副主任中藥師鑒定為石竹科植物麥藍菜Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke 的干燥成熟種子。

1.2 細胞 RAW 264.7 小鼠單核巨噬細胞，購自American Type Culture Collection（ATCC，USA）細胞資源中心。

1.3 儀器 SW?CJ?1FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DYS?810 型顯微鏡（上海點應光學儀器有限公司）；HH4Y 型恒溫水浴鍋（上海啟前電子科技有限公司）；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；DOI?50 型恒溫培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司）；LDZX?40BI 型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；酶標儀和PCR 擴增儀（美國Thermo Scientific 公司）。

2 方法

2.1 王不留行醇提物制備 取藥材王不留行于高速中藥粉碎機中打成藥材粉末，過3 號篩（60 目篩），按1 ∶10 料液比用石油醚回流脫脂2 h，加熱蒸發(fā)至沒有石油醚味，按料液比1 ∶10 加入80%乙醇，回流提取3 次，每次2 h，將所得濾液合并，減壓濃縮至沒有醇味，冷凍干燥，即得［3］。

2.2 RPMI?1640 完全培養(yǎng)基配制 RPMI?1640 培養(yǎng)基中添加10%滅活FBS 和1%青霉素，即得。

2.3 LPS 溶液配制 稱取5 mg LPS 至量瓶中，加入PBS定容至10 mL，制成500 mg／L LPS 溶液，－20 ℃避光保存。取適量LPS 溶液，RPMI?1640 完全培養(yǎng)基稀釋至500 ng／mL后，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 王不留行醇提物配制 稱取100 mg 王不留行醇提物溶于1.0 mL DMSO，制得100 mg／mL 母液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，分別用RPMI?1640 完全培養(yǎng)基制成孔內(nèi)終質(zhì)量濃度為80、40、20、10 μg／mL，即得。

2.5 MTT 法測定王不留行醇提物對RAW264.7 巨噬細胞細胞活力的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按照4.0×104／孔的細胞濃度接種在96 孔板中，之后放置在5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2 天棄去原培養(yǎng)基，進行分組處理，正常組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入80、40、20、10 μg／mL含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)24 h，每組6 個復孔。次日，每孔加入20 μL MTT 溶液，置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，并加入150 μL／孔DMSO 溶解，水平振蕩器搖動10 min后收集DMSO 溶液，測定490 nm 波長下的OD。

2.6 MTT 法測定H2O2對RAW264.7 巨噬細胞的細胞活力影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按照4.0×104／孔的細胞濃度接種在96 孔板中，之后放置在5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2 天棄去原培養(yǎng)基，進行分組處理，正常組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，其余各組分別加入不同濃度的H2O2溶液，每組6 個復孔。次日，每孔加入20 μL 的MTT 溶液，置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h 后吸棄培養(yǎng)液，并加入150 μL／孔的DMSO 溶解，水平振蕩器搖動10 min 后收集DMSO 溶液，測定490 nm 波長下的吸光度［4］。

2.7 Griess 法測定王不留行醇提物對RAW264.7 的NO 水平影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按照4.0×104／孔的細胞濃度接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，進行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h，每組6 個復孔，2 h 后除了正常組，其余均加入500 ng／mL LPS 造模并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。次日，收集各孔培養(yǎng)基100 μL，并依照一氧化氮檢測試劑盒說明，測定540 nm波長下OD，計算各組NO 水平。

2.8 王不留 行醇提物對TNF?α、IL?1β、IL?6 和iNOS mRNA 表達影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按照4.0×104／孔的細胞濃度接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，進行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h，除了正常組其余各組均加入500 ng／mL LPS造模并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照Total RNA 提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR 試劑盒說明書進行操作，測定各樣品的TNF?α、IL?1β、IL?6、iNOSmRNA 表達。RT?PCR擴增反應采用CFX 96TM Real?Time PCR Detection System 擴增儀對cDNA 進行擴增，條件為95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，40 個循環(huán)；60 ℃、60 s，40 個循環(huán)，引物序列如表1 所示。以β?actin為內(nèi)參基因，計算相對表達量2－ΔΔCt：ΔCt（對照組）＝Ct（對照組目的基因）－Ct（對照組β?actin），ΔCt（正常組）＝Ct（正常組目的基因）－Ct（正常組β?actin），ΔΔCt＝ΔCt（對照組）－ΔCt（正常組），相對表達量＝2－ΔΔCt。

表1 目標基因引物序列

2.9 王不留 行醇提物對TNF?α、IL?1β、IL?6、PGE2、COX?2 表達影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按4.0×104／孔接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，進行分組處理，正常組和模型組加入含0.1%DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h，每組6 個復孔，2 h 后除了正常組，其余各組均加入500 ng／mL LPS 培養(yǎng)24 h。次日，收集各孔培養(yǎng)基，依照ELISA 試劑盒說明測定TNF?α、IL?1β、IL?6、PGE2、COX?2 水平。

2.10 王不留行醇提物對CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7 巨噬細胞，按4.0×104／孔接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，進行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)24 h，每組6 個復孔，24 h 后除了正常組，其余各組均加入600 μmol／L H2O2培養(yǎng)4 h。4 h 后收集各孔培養(yǎng)基，依照試劑盒說明測定CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平。

2.11 統(tǒng)計學分析 分別采用Graphpad Prism 6、SPSS 23.0軟件進行制圖、統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較滿足方差齊性則用LSD 分析，不滿足方差齊性則用Dunnett T3 分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 王不留行醇提物對RAW264.7 巨噬細胞的細胞活力影響 如圖1 所示，10、20、40 μg／mL 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞的細胞活力具有較好的維持作用，分別達到95.73%、96.89%、92.77%；80 μg／mL 王不留行醇提物給藥組細胞活力為89.14%，但相比其余3 個較弱，因此本實驗選擇給藥劑量為10、20、40 μg／mL。結(jié)果表明，10～80 μg／mL 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞沒有毒性。

圖1 王不留行醇提物對RAW264.7細胞的細胞活力影響（n＝6）

3.2 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞TNF?α、IL?1β、IL?6 表達的影響 如圖2 所示，與正常組比較，RAW264.7細胞受到LPS 刺激后，TNF?α、IL?1β、IL?6 蛋白和mRNA表達均提高（P＜0.01）；給予王不留行醇提物干預后，TNF?α、IL?1β、IL?6 蛋白和mRNA 表達下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），其中40 μg／mL 王不留行醇提物給藥組下調(diào)效果最為突出，TNF?α mRNA 相對表達下降至42.46 倍，蛋白表達下降至505.00 pg／mL。

3.3 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞iNOS 和COX?2 信號通路表達影響 如圖3 所示，與正常組相比，模型組iNOSmRNA 表達及NO、COX?2、PGE2水平增 加（P＜0.01）；給予20、40 μg／mL 王不留行醇提物干預后，iNOSmRNA 表達和NO 分泌水平受到抑制（P＜0.05，P＜0.01），10、20、40 μg／mL 王不留行醇提物對RAW264.7 可抑制COX?2、PGE2表達（P＜0.01）。

圖3 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞iNOS 和COX?2 表達的影響（n＝6）

3.4 H2O2對RAW264.7 巨噬細胞的細胞活力影響 如圖4所示，不同濃度H2O2對RAW264.7 細胞活力造成不同影響，且隨著H2O2濃度增大，其對細胞的損傷越大。當H2O2濃度低于600 μmol／L 對細胞造成的損傷不顯著，濃度超過600 μmol／L 則對細胞造成過度死亡。因此本次實驗選擇600 μmol／L H2O2作為誘導RAW264.7 細胞體外氧化損傷模型的濃度藥物。

圖4 不同濃度H2O2 對RAW264.7 細胞活力影響（n＝6）

3.5 王不留行醇提物對RAW264.7 細胞CAT，SOD 和GSH?PX活性和MDA 水平影響 如圖5 所示，H2O2刺激RAW264.7 巨噬細胞后，細胞CAT、SOD、GSH?PX 水平均下調(diào)，MDA 水平升高（P＜0.01）；給予王不留行醇提物干預后，細胞CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），其中40 μg／mL王不留行醇提物給藥組藥效最好，CAT 水平由6.38 U／mL漲 至17.15 U／mL，SOD 水平由1.50 U／mL 漲 至17.15 U／mL，GSH?PX 水平由11.98 漲至44.52 U／L，MDA 水平由21.10 nmol／mL 降至12.00 nmol／mL。

圖5 王不留行醇提物對RAW264.7 巨噬細胞CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平的影響（n＝6）

4 討論

采用小鼠RAW264.7 巨噬細胞作為實驗載體，探討藥物是否對細胞活性具有干擾作用。結(jié)果說明10～80 μg／mL王不留行醇提物對RAW264.7 細胞沒有細胞毒性。接著采用LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞作為體外炎癥模型，采用H2O2誘導RAW264.7 巨噬細胞作為體外氧化損傷模型，探討王不留行醇提物抗炎抗氧化活性。

腫瘤壞死因子（TNF?α）是炎癥級聯(lián)反應中最重要的因子之一，能誘發(fā)白介素1β（IL?1β），白介素6（IL?6）等炎性因子的分泌并參與組織、器官以及機體的損傷等重要的炎癥反應過程［5?6］。實驗結(jié)果顯示，給予王不留行醇提物干預后，TNF?α、IL?1β 及IL?6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達顯著下調(diào)，表明了王不留行具有抗炎活性。進一步探討研究發(fā)現(xiàn)王不留行醇提物抗炎活性與其調(diào)控調(diào)控誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）和環(huán)氧化酶2（COX?2）信號通路蛋白表達有關(guān)。iNOS 和COX?2 在體內(nèi)分別誘導一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）生成。過高含量NO 和PGE2引起氧化反應并損傷細胞，造成多種炎癥疾病［7?8］。因此，調(diào)控iNOS 和COX?2 表達，抑制NO 和PGE2的過度生成，可以抑制炎性反應的進程［9?11］。本實驗結(jié)果顯示，給予王不留行醇提物干預后，iNOS mRNA 水平和COX?2 表達顯著下降。實驗結(jié)果表明王不留行醇提物能夠調(diào)控iNOS 和COX?2 信號通路蛋白表達，抑制下游的TNF?α，IL?1β 及IL?6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達，發(fā)揮抗炎活性。

過氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?PX）是機體內(nèi)調(diào)控氧化應激的重要相關(guān)酶，對機體的氧化與抗氧化的平衡起著至關(guān)重要的作用［12?14］。丙二醛（MDA）為不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其在體內(nèi)的堆積會造成細胞和組織損傷。本研究結(jié)果顯示，在給予王不留行醇提物后，細胞中CAT，SOD 和GSH?PX 活性明顯提高，同時MDA 含量顯著降低，說明王不留行醇提物具有促進抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應的藥物活性。

綜上所述，本研究證明了王不留行通過抑制iNOS 和COX?2 信號通路發(fā)揮抗炎活性，以及通過促進抗氧化酶活性，恢復體內(nèi)氧化與抗氧化平衡，發(fā)揮抗氧化活性。