茯苓酸對舌鱗狀細胞癌細胞CAL?27 增殖、凋亡及細胞周期的影響

樊燕青，孫蘭池，李大鵬

（1.昆明醫科大學，云南 昆明650500； 2.大同市第三人民醫院口腔科，山西 大同 037000）

舌鱗狀細胞癌是常見的惡性腫瘤，約占口腔惡性腫瘤的40%［1］。舌鱗狀細胞癌惡性程度高，浸潤性強，易發生淋巴結轉移。目前，舌鱗狀細胞癌的治療主要采取以手術為主的綜合治療，但患者預后較差，5 年生存率低［2］，因此，尋找用于治療舌鱗狀細胞癌的新藥具有積極意義。茯苓酸（pachymic acid，PA）是中藥茯苓的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功效［3］。近年來，茯苓酸的抗腫瘤作用備受關注。研究顯示，茯苓酸可抑制腎癌、胃癌、膀胱癌等腫瘤中細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡［4?6］。然而，茯苓酸在舌鱗狀細胞癌的作用及其調控機制還未知。本研究以舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞為研究對象，主要探討了茯苓酸對CAL?27 細胞增殖、凋亡、細胞周期的影響及。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 茯苓酸，貨號MR80187，純度≥98%，20 mg／支，上海銘睿生物科技有限公司（準確稱取0.529 mg茯苓酸于10 mL 量瓶中，加入10 μL 二甲基亞砜，茯苓酸溶解后超純水定容至10 mL，配制為100 μmol／L 母液，使用時培養基稀釋為所需濃度）。DMSO，國藥編號30072418，國藥集團化學試劑有限公司（取10 μL DMSO用超純水定容至10 mL，配制1%DMSO 溶液，使用時用培養基稀釋10 倍）。舌鱗狀細胞癌細胞CAL?27，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清（FBS，批號20190510）、RPMI 1640 培養基（批號20190311）、膜聯蛋白V（Annexin V）?異硫氰酸熒光素（FITC）／碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒（批號20190421）、細胞周期試劑盒（批號201900324）和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒（批號20190329），北京索萊寶生物科技有限公司；四甲基噻唑藍（MTT）和胰蛋白酶，美國Sigma 公司；LipofectamineTM2000 試劑盒，美國Invitrogen 公司；兔抗人細胞周期蛋白依賴性激酶Ⅱ（CDK2，批號20190225）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1，批號20181229）、活化的半胱天冬酶?3（Cleaved caspase?3，批號20181225）和CXC 趨化因子受體4（CXCR4，批號20190123）多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；活化的多聚ADP 核糖多聚糖（Cleaved PARP）抗體，批號20190126，武漢三鷹生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CAL?27 細胞培養和轉染 復蘇CAL?27 細胞，用含10% FBS 的RPMI 1640 培養基培養CAL?27 細胞。取對數期CAL?27 細胞接種至6 孔板中（1.0×105／孔），培養24 h 后棄培養基。利用LipofectamineTM2000 試劑盒，分別轉染CXCR4 過表達載體（pcDNA?CXCR4）及空載體（pcDNA）至CAL?27 細胞。轉染12 h 后，棄培養液，重新加含10%FBS 的RPMI 1640 培養基。再培養24 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 MTT 檢測細胞增殖 CAL?27 細胞或轉染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細胞均接種于96 孔板中（1.0×104個），培養12 h 后分組處理。CAL?27 細胞分為空白組、0.1% DMSO 組、茯苓酸2 μmol／L 組、茯苓酸4 μmol／L 組和茯苓酸8 μmol／L 組，其中空白組細胞用常規培養基干預48 h，0.1% DMSO 組細胞用含0.1% DMSO 的培養基干預48 h，茯苓酸2 μmol／L 組、茯苓酸4 μmol／L 組、茯苓酸8 μmol／L組細胞分別用含2、4、8 μmol／L［7］茯苓酸的培養基干預48 h。轉染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細胞均用含8 μmol／L 茯苓酸的培養基干預48 h，并分別記為茯苓酸＋pcDNA?CXCR4 組、茯苓酸＋pcDNA 組。培養結束后，每孔加20 μL MTT（5 mg／mL）。孵育4 h 后，棄培養基，加150 μL DMSO，混合均勻，于酶標儀490 nm 處測OD。細胞存活率＝（OD實驗組／OD對照組）×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 CAL?27 細胞或轉染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細胞接種于24 孔板中（2.5×104個），培養12 h 后，按照“1.2.2”分組處理。培養結束后，棄培養基，收集各組細胞。用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次后，加500 μL 結合緩沖液，重懸細胞。加10 μL Annexin V?FITC，室溫避光孵育10 min。再加5 μL PI，室溫避光孵育5 min 后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 CAL?27 細胞或轉染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細胞接種于24 孔板中（2.5×104個），培養12 h 后按“1.2.2”項下方法分組處理，培養結束后棄培養基，收集各組細胞。用PBS 液清洗2 次后，加70% 乙醇4 ℃固定24 h，離心（2 000 r／min、5 min），棄上清，加PBS 重懸細胞，離心（2 000 r／min、5 min），棄上清，加100 μL RNase A 重懸細胞，37 ℃水浴30 min 后，加400 μL PI，4 ℃避光孵30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5 Western blot 法檢測 細胞中 CyclinD1、CDK2、Cleaved PARP、Cleaved caspase?3 和CXCR4 蛋白表 達CAL?27 細胞或轉染pcDNA?CXCR4、pcDNA 的CAL?27 細胞接種于24 孔板中（2.5×104個），培養12 h 后按“1.2.2”項下方法分組處理，培養結束后棄培養基，收集各組細胞。用RIPA 蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，經BCA 法定量、行十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜及封閉后，分別用CyclinD1（1 ∶ 500）、CDK2（1 ∶ 500）、Cleaved PARP（1 ∶1 000）、Cleaved caspase?3（1 ∶1 000）、CXCR4（1 ∶1 000）和β?actin（1 ∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜。洗膜后，再用加入辣根過氧化酶標記的二抗IgG（1 ∶2 000）37 ℃孵育1 h。滴加顯影液，避光顯影后，曝光拍照，Image J 軟件分析目的蛋白相對于β?actin 的表達。

1.3 統計學分析 利用SPSS 22.0 軟件分析實驗數據。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度茯苓酸對舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞增殖的影響 由表1 可見，與空白組比較，0.1% DMSO 組舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞存活率無變化（P＞0.05）；與0.1%DMSO 組比較，不同劑量茯苓酸組舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞存活率降低（P＜0.05）。

表1 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞增殖的影響（， n＝9）

表1 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞增殖的影響（， n＝9）

注：與0.1% DMSO 組比較，*P＜0.05。

2.2 不同濃度的茯苓酸對舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞凋亡的影響 由圖1、表2 可見，與空白組比較，0.1% DMSO組舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達無變化（P＞0.05）；與0.1%DMSO 組比較，不同劑量茯苓酸組舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達升高（P＜0.05）。

表2 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞凋亡的影響（， n＝9）

注：與0.1%DMSO 組比較，*P＜0.05。

圖1 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞凋亡和Cleaved caspase?3、Cleaved PARP 蛋白表達的影響

2.3 不同濃度的茯苓酸對舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞周期的影響 由圖2、圖3、表3 可見，與空白組比較，0.1%DMSO 組CAL?27 細胞G0?G1 期、S 期、G2?M 期細胞數及CyclinD1 和CDK2 蛋白水平無明顯變化（P＞0.05）；與0.1% DMSO 組比較，不同劑量茯苓酸組G0?G1 期細胞數升高（P＜0.05），S 期和G2?M 期細胞數降低（P＜0.05），CyclinD1 和CDK2 蛋白表達降低（P＜0.05）。

表3 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞周期的影響（， n＝9）

表3 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞周期的影響（， n＝9）

注：與0.1%DMSO 組比較，*P＜0.05。

圖2 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞中CyclinD1 和CDK2 蛋白表達的影響

圖3 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞周期的檢測

2.4 不同濃度的茯苓酸對舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞CXCR4 表達的影響 由圖4、表4 可見，與空白組比較，0.1% DMSO 組舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞中CXCR4 蛋白表達無變化（P＞0.05）。與0.1% DMSO 組比較，不同劑量茯苓酸組舌鱗狀細胞CAL?27 細胞中CXCR4 蛋白表達降低（P＜0.05）。

表4 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞CXCR4 表達的影響（， n＝9）

表4 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞CXCR4 表達的影響（， n＝9）

注：與0.1%DMSO 組比較，*P＜0.05。

圖4 不同濃度的茯苓酸對CAL?27 細胞中CXCR4 蛋白表達的影響

2.5 過表達CXCR4 降低茯苓酸對舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞增殖和細胞周期的影響 由圖5、圖6、表5 可見，與茯苓酸＋pcDNA 組比較，茯苓酸＋pcDNA?CXCR4 組CAL?27 細胞CXCR4 蛋白表達和細胞存活率升高（P＜0.05），G0?G1 期細胞數降低（P＜0.05），S 期和G2?M 期細胞數升高（P＜0.05），CyclinD1 和CDK2 的蛋白表達升高（P＜0.05）。

表5 茯苓酸對過表達CXCR4 的CAL?27 細胞增殖和細胞周期的影響（， n＝9）

表5 茯苓酸對過表達CXCR4 的CAL?27 細胞增殖和細胞周期的影響（， n＝9）

注：與0.1% DMSO 組比較，*P＜0.05；與茯苓酸＋pcDNA 組比較，＃P＜0.05。

圖5 茯苓酸對過表達CXCR4 的CAL?27細胞中CXCR4 蛋白表達的影響

圖6 茯苓酸對過表達CXCR4 的CAL?27 細胞周期的影響

2.6 過表達CXCR4 降低茯苓酸促進舌鱗狀細胞癌CAL?27細胞凋亡 由圖7、表6 可見，與茯苓酸＋pcDNA 組比較，茯苓酸＋pcDNA? CXCR4 組舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞凋亡率、Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達降低（P＜0.05）。

圖7 茯苓酸對過表達CXCR4 的CAL?27 細胞凋亡及Cleaved caspase?3 和Cleaved PARP 蛋白表達的影響

表6 茯苓酸對過表達CXCR4 的CAL?27 細胞凋亡的影響（， n＝9）

表6 茯苓酸對過表達CXCR4 的CAL?27 細胞凋亡的影響（， n＝9）

注：與0.1%＋DMSO 組比較，*P＜0.05；與茯苓酸＋pcDNA 組比較，＃P＜0.05。

3 討論

舌鱗狀細胞癌具有較高的發病率，且易發生轉移［8］。目前，舌鱗狀細胞癌以手術治療為主，但多數患者術后存在面容改變及部分顏面功能喪失的情況，生活質量受到影響。舌鱗狀細胞癌的發生發展是一個多因素、多階段、多基因的復雜過程。細胞的異常增殖和凋亡在腫瘤的發生發展中起重要作用，因此，尋找抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的藥物對于治療舌鱗狀細胞癌及改善患者預后均具有重要意義。

茯苓酸是茯苓的主要活性成分，其抗腫瘤作用受到廣泛作用。研究顯示，茯苓酸可抑制胃癌SGC?7901 細胞的活力，誘導SGC?7901 細胞的G0－ G1細胞周期阻滯和細胞凋亡，具有一定的抗胃癌作用［9］。本研究顯示，茯苓酸作用舌鱗狀細胞癌CAL?27 細胞后，CAL?27 細胞存活率降低，G0?G1期細胞數增加，而S 期和G2?M 期細胞數降低，這說明茯苓酸可阻滯CAL?27 細胞周期進程，抑制細胞增殖。此外，茯苓酸作用CAL?27 細胞后，細胞凋亡率明顯升高，說明茯苓酸可誘導CAL?27 細胞凋亡。上述結果說明茯苓酸也發揮抗舌鱗狀細胞癌的作用，是治療舌鱗狀細胞癌的潛在藥物。

細胞增殖受細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調控［10］。CyclinD1 可促進細胞周期由G1期向S 期轉變，縮短細胞周期，加速細胞增殖［11］。CDK2 與相應的Cyclin 結合后被激活，使細胞通過G1／S 期檢驗點并進入S 期。誘導細胞凋亡是腫瘤治療的一種途徑。PARP 是一類蛋白質翻譯修飾酶，參與調控細胞凋亡［12］。PARP 被過度激活時，可引起細胞能量耗竭進而引起細胞凋亡［13］。caspase 級聯反 應參與 細胞凋 亡，caspase?3 是caspase 級聯反應的關鍵調控分子，其被活化后執行細胞凋亡。本研究顯示，茯苓酸作用CAL?27 細胞后，細胞中CyclinD1 和CDK2 蛋白表 達降低，而Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達升高，說明茯苓酸可通過調控CyclinD1、CDK2 及Cleaved PARP 和Cleaved caspase?3 蛋白表達抑制舌鱗狀細胞癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡。

CXCR4 是典型的G 蛋白偶聯受體，與子宮內膜癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的發生發展密切相關［14?16］。Duan等［17］研究顯示，沉默CXCR4 表達可在體外阻礙舌鱗狀細胞癌細胞遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，且在體內通過抑制基質金屬蛋白酶2／9 的蛋白表達、促進E?鈣粘蛋白表達進而抑制腫瘤轉移。孫小英等［18］研究顯示，舌鱗狀細胞癌組織中CXCR4 蛋白表達高于癌旁組織，上調CXCR4 表達可增強舌鱗狀細胞癌細胞Tca8113 的增殖、侵襲和遷移能力。為了進一步探討茯苓酸發揮抗舌鱗狀細胞癌的作用機制，本研究首先檢測了茯苓酸對CAL?27 細胞中CXCR4 蛋白表達的影響，結果顯示，茯苓酸可降低CAL?27 細胞中CXCR4 蛋白表達，而過表達CAL?27 細胞中CXCR4 后，茯苓酸對CAL?27 細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響降低，提示茯苓酸通過下調CAL?27 細胞中CXCR4 表達發揮抗舌鱗狀細胞癌作用。

綜上所述，茯苓酸可抑制舌鱗狀細胞癌細胞CAL?27 增殖，誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期進程，其作用機制與下調細胞中CXCR4 表達有關。本研究尚存在不足之處，僅在細胞層面初步探討了茯苓酸對舌鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，接下來本研究將通過動物模型實驗進一步探討茯苓酸對舌鱗狀細胞癌腫瘤生長的影響及作用機制。