UHPLC、HPLC 法同時測定白癜風膠囊中5 種成分

劉晶晶，何 軼，胡曉茹，戴 忠，馬雙成

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

白癜風膠囊收載于2020 年版《中國藥典》 一部，功效活血行滯、祛風解毒，用于治療經絡阻隔、氣血不暢所致的白癜風，由補骨脂、紅花、蒺藜、黃芪、川芎、當歸、香附、桃仁、丹參、烏梢蛇、紫草、白鮮皮、山藥、干姜、龍膽等15 味藥材組成［1］，但其現有質量標準只檢測補骨脂素、異補骨脂素，難以全面控制質量［2］。與傳統HPLC 法相比，UHPLC 法具有靈敏度和分離度更高、分析速度更快等優勢，在中藥質量控制種得到越來越廣泛的應用［3?4］。因此，本實驗建立了HPLC、UHPLC 法分別檢測白癜風膠囊中4?香豆酸、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮的含量，發現2 種方法所得結果基本一致，但UHPLC 法分離度、靈敏度更高，分析時間更短，并且部分成分在UHPLC 下可分離出HPLC 法中未分開的雜質峰，導致出現一定差異，故兩者不能簡單互換，而應研究建立其方法轉移的驗證步驟。

1 材料

Waters Acquity Arc 系列液相色譜儀（配置四元低壓梯度泵、在線脫氣機、柱溫箱和自動進樣器、Empower3 色譜工作站，美國Waters 公司）；AE240、XS105DU 電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；KQ?300DA 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W、頻率40 kHz）。4?香豆酸（批號18040301，純度99.3%）、補骨脂素（批號18040301，純度99.7%）、異補骨脂素（批號18040301，純度99.5%）、補骨脂二氫黃酮（批號18040301，純度99.4%）、新補骨脂異黃酮（批號18040301，純度99.6%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。XBridge? Shield RP18（5 μm，4.6 mm×250 mm）、XBridge BEH C18XP（2.5 μm，3 mm×150 mm）色譜柱均購自美國Waters 公司。白癜風膠囊購自長春銀諾克藥業有限公司、哈爾濱大洋制藥股份有限公司、天津宏仁堂藥業有限公司。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 參考文獻［5?7］ 報道。

2.1.1 UHPLC XBridge BEH C18XP 色譜柱（3 mm×150 mm，2.5 μm）；流動相甲醇（A）?0.15% 甲酸溶 液（B），梯度洗脫（0～2 min，5.0%A；2.0～6.0 min，5.0%～25.0% A；6.0～12.0 min，25.0%～35.0% A；12.0～20.0 min，35.0%～45.0% A；20.0～28.0 min，45.0%～70.0% A；28.0～32.0 min，75.0%～95.0% A；32.0～40.0 min，5.0%A）；體積流量0.6 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長300 nm；進樣量2 μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 HPLC XBridge? Shield RP18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）?0.15% 甲酸溶 液（B），梯度洗脫（0～5 min，5.0% A；5.0～15.0 min，5.0%～25.0% A；15.0～30.0 min，25.0%～35.0% A；30.0～50.0 min，35.0%～45.0% A；50.0～70.0 min，45.0%～70.0% A；70.0～80.0 min，75.0%～95.0% A；80.0～90.0 min，5.0% A）；體積流 量1 mL／min；柱 溫35 ℃；檢測波長300 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分UHPLC、HPLC 色譜圖

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取4?香豆酸、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮對照品適量，甲醇溶解，制成每1 mL 分別含0.411、0.796、0.838、0.426、1.341 mg 上述成分的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取研勻后膠囊內容物1.0 g，精密加入25 mL 甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，濾過，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性溶液 按處方比例和制備工藝，制備缺補骨脂、缺紅花的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 線性關系考察 取“2.2.1”項下對照品溶液，依次稀釋至0.5、0.2、0.1、0.04、0.02、0.05、0.01 倍，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。再以S／N≥3 為為檢出限，測得4?香豆素酸、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮檢出限（UHPLC／HPLC）分別為3.28×10－6／3.28×10－5、6.37×10－6／6.37×10－5、6.70×10－6／6.70×10－5、3.41×10－6／3.41×10－5、1.073×10－5／1.073×10－4mg／mL；以信噪比S／N ≥10 為定量限，測得各成分檢出限（UHPLC／HPLC）分別為8.22×10－6／8.22×10－5、1.59×10－5／1.59×10－4、1.68×10－6／1.68×10－5、8.52×10－6／8.52×10－5、2.68×10－5／2.68×10－4mg／mL。

表1 各成分線性關系

2.4 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得4?香豆酸、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮峰面積RSD（UHPLC／HPLC）分別為2.92% ／2.52%、1.59% ／1.26%、1.20% ／1.89%、2.62% ／1.80%、2.91% ／1.78%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗 取膠囊（批號6022）適量，研細，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得4?香豆酸、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮含量RSD（UHPLC／HPLC）分別為1.60% ／3.73%、0.93% ／3.20%、1.02% ／4.67%、2.75% ／3.41%、1.39% ／3.20%，表明該方法重復性良好。

2.6 穩定性試驗 取同一批膠囊（批號6022）適量，研細，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得4?香豆素酸、補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂二氫黃酮、新補骨脂異黃酮峰面積RSD（UHPLC／HPLC）分別為3.41% ／2.07%、2.41% ／1.26%、1.16% ／1.51%、4.34% ／1.94%、1.17% ／0.68%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的膠囊（批號6022）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，加入適量對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.8 樣品含量測定 取3 個廠家生產的膠囊適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3，可知2 種方法所得結果除補骨脂素外，其他成分含量無明顯差異。

表3 各成分含量測定結果

2.9 HPLC?MS 分析 結果見圖2。

圖2 補骨脂素相應色譜峰的HPLC?MS／MS 色譜圖

2.9.1 色譜條件 同“2.1”項。

2.9.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子檢測模式；載氣氮氣，分流進樣，分流比4 ∶6；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣N2，體積流量600 L／h；霧化器壓力0.2 MPa；子離子掃描，質量范圍m／z100～1 000；母離子m／z443，碎裂電壓50 V，碰撞能量8 eV；母離子m／z187，碎裂電壓25 V，碰撞能量25 eV。

3 討論

3.1 轉換方法研究 本實驗對HPLC、UHPLC 法的轉換進行研究，發現轉化后方法靈敏度、分離度有提高［8?9］，分析時間縮短，溶劑消耗減少。2 種方法所得色譜圖的出峰順序和數量、分離效果、拖尾因子基本一致，但UHPLC 法分離度、理論塔板數略優于HPLC 法；流動相、溫度等細微改變可對HPLC 法產生影響，但UHPLC 法靈敏度高，檢測時間更短［10?12］；除補骨脂素外，其他成分含量測定結果無明顯差異。

3.2 轉換適用性研究 UHPLC 可將HPLC 色譜峰中的雜質分開，從而導致測定結果不同。圖2 顯示，HPLC 法所得補骨脂素峰分離較好，但由于UHPLC 法分離度更高，可將補骨脂素峰中的雜質分離；UHPLC 所得2 個峰的準分子離子分別為m／z187、443，而HPLC 色譜圖中兩者均可在補骨脂素色譜峰中檢出，證明它為混合峰。表4 顯示，UHPLC法測得各成分含量較HPLC 法均偏低，而且比例不同，可能是由于各批次原料差異所致。由于中藥成分復雜，故在測定中藥及其復方制劑中成分含量時，不應簡單將UHPLC法與HPLC 法轉移使用。

參考最新版《美國藥典》（USP42?NF37）通則（General Chapter）＜621＞相關規范，等度洗脫時可對HPLC、UHPLC法進行轉換應用，但梯度洗脫時不允許。本實驗所得結果與《美國藥典》 相符，并且梯度洗脫時由于分離能力差異，導致HPLC、UHPLC 法峰型、峰數、各成分含量有所不同。