北五味子飲片等級標準及質量評價

尹程程，楊 洋，趙大慶，陳昊媛，張 旭，范莎莎，齊 濱*，睢博文*

（1.長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，吉林 長春130117； 2.長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117）

北五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，具有益氣生津、收斂固澀、補腎寧心等功效［1］，始載于《神農本草經》，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種功效，對肝損傷、心血管疾病、神經系統、腫瘤、糖尿病等均有不同程度治療作用［2?10］，主要含有木脂素類、多糖類、揮發油類［11］。中藥有效成分的含量與飲片質量之間存在一定相關性［12］，為保證中藥臨床療效，對其質量控制至關重要。北五味子為吉林省珍貴道地藥材，由于市場行情波動較大，導致出現以次充好、“搶青”等現象，嚴重影響了其臨床藥效。

《七十六種藥材商品規格標準》 及《中藥材商品規格等級標準匯編》 均記載北五味子“呈不規則球形或橢圓形，皺縮，內有腎形種子1～2 粒。果肉微酸，種子有香氣，味辛微苦。”并根據顏色、有無白霜、干癟粒重對北五味子進行等級劃分，但對于有白霜顏色鮮紅者或無白霜顏色暗紅者無法準確劃分等級，并且等級劃分忽略了有效成分對其的影響。本研究收集北五味子，并探討外在指標與內在含量直接關聯，以期為建立該藥材等級劃分體系提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC?2030 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ5200 型臺式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；ST?40R 型高速冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 藥物與試劑 對照品五味子醇甲（批號DST191010?010）、五味子醇乙（批號DST190807?013）、五味子甲素（批號DST190908?008）、五味子乙素（批號DST190819?009），純度均≥98%，購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；水為屈臣氏水。

1.3 飲片 北五味子飲片從不同產地收集而來，信息見表1，均由長春中醫藥大學肖井雷副教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 Vision HT C18HL 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相乙腈（A）?水（B），梯度洗脫（0～40 min，45%～55%A；40～55 min，55%～61%A；55～75 min，61%～70%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長250 nm。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品五味子醇甲9.71 mg、五味子醇乙2.66 mg、五味子甲素2.28 mg、五味子乙素6.42 mg，置于量瓶中，甲醇定容至10 mL，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取北五味子粉末，過3號篩，精密稱取0.25 g，加入25 mL 正己烷，稱定質量，超聲（250 W、50 kHz）處理30 min，正己烷補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項條件下連續進樣6 次，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD 分別為1.65%、1.70%、1.57%、1.86%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 精密稱取北五味子6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項條件下于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD 分別為1.25%、0.39%、0.54%、0.47%，表明溶液在24 h 穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 精密稱取北五味子6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項條件下進樣，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD 分別為0.96%、1.10%、0.63%、0.19%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，甲醇稀釋定容至5 mL，分別吸取10 μL，在“2.1.1”項條件下檢測。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表2，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.8 加樣回收率試驗 取北五味子（樣品1）飲片粉末0.25 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，加入各對照品適量（五味子醇乙0.266 mg、五味子醇甲0.971 mg、五味子甲素0.228 mg、五味子乙素0.642 mg），混勻，在“2.1.1”項條件下檢測，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.1.9 樣品含量測定 取樣品（1～50 號）各0.25 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液。各取10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，色譜圖見圖1，再計算含量，結果見表4。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 外觀性狀參數篩選 參考《七十六種藥材商品規格標準》 及《中藥材商品規格等級標準匯編》中劃分北五味子等級的外觀性狀指標，結合2020年版《中國藥典》 對北五味子性狀的描述，選擇干癟粒質量占比作為指標進行測定。

2.3 內在質量參數篩選 北五味子藥理活性主要與其木脂素類成分有關，占比2%～8%，已鑒定出來的多達31 種［13?14］。其中，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量較高，藥理活性廣泛，并且五味子醇甲為2020 年版《中國藥典》 中北五味子含量測定項，因此本實驗在進行等級研究時選擇藥理活性廣泛、含量高的成分作為指標，同時參照2020 年版《中國藥典》 測定北五味子雜質（通則2301）、水分（通則0832 第二法）、總灰分（通則2302），結果見表4。

表4 各樣品內在指標測定結果（%）Tab.4 Measurement results for internal indices of various samples（%）

2.4 相關性分析 采用SPSS 軟件，對影響北五味子外觀性狀、內在指標的干癟質量占比、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、雜質、水分、總灰分、酸不溶性灰分進行相關性分析，結果見表5。北五味子干癟粒質量占比與北五味子五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素及四種木脂素含量之和均有統計學意義（P＜0.01），并且均呈負相關；干癟粒質量占比與五味子醇甲、五味子乙素呈強相關性，與五味子醇乙、五味子甲素呈一般相關性。

表5 Person 相關性分析結果Tab.5 Results of Pearson correlation analysis

2.5 主成分分析 主成分分析是一種能夠通過采用降維和因子分析，將多個變量轉化為較少的變量來獲取原始數據中的大部分變異的統計學方法［15?17］。采用SPSS 22.0 軟件對影響北五味子質量的相關指標進行分析，結果見表6，提取特征值＞0.5 的主成分，可得到3 個，見表7，分別對應因子1、因子2、因子3，累積貢獻率可達95.12%。

表6 主成分初始特征值和貢獻率Tab.6 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表7 主成分矩陣與特征向量Tab.7 Principal components’ matrices and feature vectors

根據特征向量及累積貢獻率建立主成分分析模型，具體如下。

F ＝59.367%F1＋20.901%F2＋14.852%F3；

F1＝0.504X1＋0.271X2＋0.418X3＋0.455X4＋0.526X5－0.118X6；

F2＝－0.096X1＋0.651X2－0.456X3＋0.316X4－0.040X5＋0.506X6；

F3＝0.064X1－0.445X2＋0.303X3＋0.044X4＋0.077X5＋0.836X6。

其中，X1、X2、X3、X4、X5、X6分別表示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、4 種木脂素之和、干癟粒質量占比這6 個原始變量標準化后的變量，F1、F2、F3表示3 個主成分的得分。以主成分貢獻率對主成分得分進行加權平均得綜合評分F，并按照模型進行評分，將得分大于0 者劃分為一等，小于0 者劃分為二等，對比市場分級方式（購買信息）、傳統分級方式與模型分級方式，結果見表8。傳統分級方式能夠對大部分北五味子商品飲片進行很好的等級劃分，但仍有樣品難以判斷其等級；模型分級方式可較為直觀反映各產地北五味子質量情況，并且分級情況與商品本身所提供的等級基本一致。

表8 五味子市場、傳統、模型分級比較Tab.8 Comparisons of Schisandra chinensis grades of market，tradition and model

2.6 正交偏最小二乘判別法分析（OPLS?DA）為進一步觀察50 批樣品差異，采用有監督模式的正交偏最小二乘判別法分析，見圖2，各批樣品經等級劃分后具有很好的分離趨勢，表明該模型的建立能根據質量對北五味子進行分類。如圖3 所示，6 個指標對北五味子質量影響大小依次為干癟粒質量占比＞4 種木質素之和＞五味子醇甲＞五味子甲素＞五味子乙素＞五味子醇乙。

圖2 各樣品OPLS?DA 得分散點圖Fig.2 OPLS?DA score scatter plot of various samples

圖3 變量重要性投影圖Fig.3 Variable importance projection

2.7 質量等級劃分 以有效成分含量為內在指標，干癟粒質量占比為外在指標，采用主成分分析模型綜合多個指標進行標準量化，結果見表8。最終，以五味子醇甲含量符合2020 年版《中國藥典》 要求，即不低于0.4%、顏色紅、無白霜、模型評分大于0 者為一等品；符合2020 年版《中國藥典》要求，即顏色暗紅、有或無白霜、模型評分小于0者為二等品，評分越高，表明飲片質量越好。

3 討論與結論

北五味子以粒大、飽滿為優，參考《七十六種藥材商品規格標準》 《中藥材商品規格等級標準匯編》 以及2020 年版《中國藥典》 中對北五味子商品飲片的等級劃分項，常以顏色、有無白霜、干癟粒進行分級。但其中不乏其他大小不一的五味子混入。北五味子主要藥效成分為木脂素類成分，同時富含有機酸［18］、萜類揮發油、多糖類成分，其中多糖類成分含量達85.56%［19］，揮發油含量可達12.2 mL／kg［20］。在儲存過程中，豐富的揮發油及多糖類成分常導致北五味子飲片，出現油脂外溢、質地返軟、發黏、顏色變深、氣味散失等現象。這也使得不法商人以“搶青”貨充當成熟北五味子的事時有發生。北五味子在長期儲存過程中表面有結晶類物質析出，稱“白霜”或“析霜”。

僅以色澤、有無白霜并不能完全代表其質量優劣，儲存環境對北五味子外觀性狀的影響也可能是導致傳統分級方式無法對某些批進行準確等級劃分的原因。本研究等級劃分模型建立時，由于顏色及有無白霜無法進行量化，綜合考慮各參考文獻所提及影響指標，采用可量化的且與質量相關的外觀性狀指標（干癟粒質量），通過數學模型對北五味子各質量相關指標進行標準化，以評分形式對商品飲片等級進行劃分。建立了能夠快速、準確的對所購北五味子進行等級劃分的方法。

綜上所述，本實驗收集50 批來源于不同道地產地的北五味子，以內在指標與外觀性狀指標建立等級劃分數學評分模型，并結合不可量化的顏色、有無白霜等性狀指標，建立較為全面的北五味子質量等級劃分模式。