不同產(chǎn)地路路通體外抗肝腫瘤作用及譜效關(guān)系

楊欣欣 張?jiān)评ね?帥 李天嬌包永睿*孟憲生

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連116600； 2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連116600； 3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院，遼寧 大連 116023）

路路通為金縷梅科植物楓香樹(shù)Liquidambar formosanaHance 的干燥成熟果序，性味苦、平，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)活絡(luò)、利水、通經(jīng)的功效［1］，生長(zhǎng)于平原及丘陵地帶，分布于我國(guó)華東、華南、西南等地，現(xiàn)代藥理研究表明，其有保肝、抗腫瘤、抑制關(guān)節(jié)炎腫脹、消炎等作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，路路通藥材中單體成分路路通酸對(duì)卵巢癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤具有良好的抑制作用［3?5］。但中藥是多組分、多靶點(diǎn)綜合作用的整體，其藥效應(yīng)由多種藥效成分共同作用的結(jié)果［6］。路路通主要有揮發(fā)油、萜類、內(nèi)酯類、黃酮類、有機(jī)酸及糖類等成分，其中揮發(fā)油、三萜類含量最為豐富［7］。探討活性部位與抗腫瘤藥效程度之間的關(guān)聯(lián)性，明確路路通抗腫瘤的藥效物質(zhì)，將成為路路通藥材在治療腫瘤方面應(yīng)用開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)在明確路路通藥材抗腫瘤藥效部位為乙酸乙酯提取物的基礎(chǔ)上，采用HPLC 法建立不同產(chǎn)地路路通藥材指紋圖譜［8］，采用人肝癌SMMC?7721 細(xì)胞體外模型開(kāi)展不同產(chǎn)地路路通抗肝腫瘤藥理藥效研究；運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)及偏最小二乘分析法，將指紋圖譜與藥效進(jìn)行關(guān)聯(lián)，獲得對(duì)藥效功效較大的色譜峰。同時(shí)，采用UPLC?QTOF?MS 技術(shù)，對(duì)其乙酸乙酯藥效部位的質(zhì)譜峰與HPLC 法獲得的色譜峰進(jìn)行比對(duì)，明確色譜峰的精準(zhǔn)分子量，找到在質(zhì)譜及色譜中表達(dá)較高、色譜分離度較好的共有峰，開(kāi)展譜效關(guān)系研究，并對(duì)其部分藥效成分進(jìn)行解析，以期待篩選出路路通抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其后期深度開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 1290 型超高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Tecan sunrise 型酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）；US AUTOFLOW 型CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Nuaire公司）；E31 型倒置相差顯微鏡（Motic 公司）。

1.2 試劑與藥物 人肝癌細(xì)胞株SMMC?7721（武漢博士德生物工程有限公司）。11 批路路通購(gòu)自安國(guó)市啟美藥材有限公司，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥植物教研室許亮教授植物鑒定為金縷梅科植物楓香樹(shù)Liquidambar formosanaHance 的干燥成熟果序，產(chǎn)地與編號(hào)分別為S1 江蘇謫氏、S2 河北保定、S3 江蘇祝文忠中醫(yī)、S4 江蘇民樂(lè)秦皇島、S5 江蘇成大方圓、S6 江蘇祁一、S7 河北鼎辰、S8 河北安國(guó)鴻翔、S9 湖南裕寶堂、S10 江蘇唐人、S11 四川。

1.3 樣品制備

1.3.1 乙酸乙酯提取物 精密稱取不同產(chǎn)地藥材粗粉約100 g，置于具塞錐形瓶中，加入1 000 mL乙酸乙酯溶液，加熱回流1 h，放冷，抽濾，揮干，即得。

1.3.2 供試品溶液 稱取乙酸乙酯提取物約0.5 g，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，冷卻后補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

1.3.3 含藥培養(yǎng)液制備 稱取乙酸乙酯提取物適量，加三級(jí)水（0.3% DMSO 助溶）制成質(zhì)量濃度為2 mg／mL 的溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得，用于后期體外藥效評(píng)價(jià)研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Agilent poroshell 120 色譜柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，5% B；10～110 min，5%～80% B）；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式測(cè)定；毛細(xì)管電壓3 800 V；干燥氣體體積流量10 L／min，溫度280 ℃；霧化器壓力45 psi（1 psi＝6.895 kPa）；鞘氣溫度350 ℃，體積流量12 L／min；碎裂電壓150 V；質(zhì)量范圍m／z50～1 200。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取8 號(hào)供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.29%～0.57%之間，相對(duì)峰面積RSD 在1.36%～2.76% 之間，均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備8 號(hào)樣品供試品溶液1份，于室溫放置0、3、6、12、24、48 h 后 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.21%～0.47%之間，相對(duì)峰面積RSD 在2.07%～3.49%之間，均小于5%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 制備8 號(hào)樣品的供試品溶液6 份，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.65%～1.36%之間，相對(duì)峰面積RSD 在2.96%～3.42%之間，均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 指紋圖譜建立 精密吸取11 批供試品溶液各2 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，指紋圖譜見(jiàn)圖1，對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖2。

圖1 11 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of eleven batches of samples

圖2 不同產(chǎn)地樣品乙酸乙酯提取物對(duì)照?qǐng)D譜Fig.2 Reference map for ethyl acetate extract of samples from different areas

在對(duì)不同儀器類型、色譜柱等指紋圖譜適用性考察的基礎(chǔ)上構(gòu)建了指紋圖譜，從中篩選出27 個(gè)主要色譜峰，得出其保留時(shí)間與峰面積，用于下一步譜效分析。

2.2 對(duì)人肝癌SMMC?7721 細(xì)胞的抑制作用 取培養(yǎng)2～3 d、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人肝癌SMMC?7721 細(xì)胞，1×PBS 清洗2 次，每次1 mL，1 mL 的胰蛋白酶消化，待細(xì)胞趨于變圓后培養(yǎng)液終止消化，并沖洗吹打制成細(xì)胞懸液，于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104／mL，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)約12 h待細(xì)胞貼壁完全。設(shè)加藥試驗(yàn)孔、空白對(duì)照孔（加細(xì)胞不加藥物），每組5 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔避光加20 μL MTT（5 mg／mL），繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后吸凈孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床振搖10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm 處掃描，測(cè)定光密度（OD）［9?12］，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地樣品乙酸乙酯提取物對(duì)人肝癌SMMC?7721 細(xì)胞的抑制率（， n＝3）Tab.1 Inhibitory effects of ethyl acetate extract of samples from different growing areas on human hepatocarcinoma SMMC?7721 cells（， n＝3）

表1 不同產(chǎn)地樣品乙酸乙酯提取物對(duì)人肝癌SMMC?7721 細(xì)胞的抑制率（， n＝3）Tab.1 Inhibitory effects of ethyl acetate extract of samples from different growing areas on human hepatocarcinoma SMMC?7721 cells（， n＝3）

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析 先將影響整體行為的數(shù)據(jù)進(jìn)行分列，以反映系統(tǒng)藥效行為特征的數(shù)據(jù)序列（細(xì)胞的抑制率）為參考數(shù)列，即母序列；以影響系統(tǒng)藥效行為的因素?cái)?shù)據(jù)序列（不同產(chǎn)地路路通藥材的不同峰面積經(jīng)歸一化處理后）為比較數(shù)列，即子系列。采用灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件（Grey ModeLing_ V3.0）進(jìn)行分析，得出不同極性藥材色譜峰與體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)［13?16］，見(jiàn)表2。

由此可知，這27 個(gè)主要色譜峰代表的化學(xué)成分對(duì)肝癌抑制作用有一定的差異性，其中相關(guān)系數(shù)大于0.7 的色譜峰為1、2、4、5、6、8、12、13、16、17、18、19、20、21、24、25、26 號(hào)，相關(guān)度依次為16th＞19th＞8th＞13th＞2th＞6th＞21th＞26th＞5th＞18th＞24th＞20th＞17th＞12th＞1th＞4th＞25th。

2.4 偏最小二乘回歸分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，以歸一化后的27 個(gè)主要色譜峰為自變量（X），藥效數(shù)據(jù)為因變量（Y）進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。回歸方程為Y＝4.602 ＋0.068X1＋0.112X2＋0.063X3＋0.073X4－0.652X5－0.144X6－0.064X7－0.539X8－0.146X9－0.005X10－0.113X11＋0.023X12－0.460X13＋0.142X14－0.026X15＋0.013X16－0.226X17－0.155X18＋0.423X19－0.039X20＋0.054X21－0.045X22－0.020X23－0.021X24＋0.164X25＋0.429X26＋0.136X27。

表3 系數(shù)估計(jì)、累積變量重要性結(jié)果Tab.3 Results of coefficient estimation and cumulative variable importance

綜合累積變量重要性結(jié)果，可見(jiàn)1、2、3、4、12、14、16、19、21、25、26、27 對(duì)藥效貢獻(xiàn)較大，起到正向促進(jìn)作用。與灰色關(guān)聯(lián)度分析比較，共有9 個(gè)色譜峰一致，相似度為75%。

2.5 HPLC?Q?TOF／MS 分析運(yùn) 用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 軟件對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，尋找各個(gè)質(zhì)譜峰所對(duì)應(yīng)的分子量，推測(cè)分子式，找出質(zhì)譜峰可能對(duì)應(yīng)的化合物，并參考文獻(xiàn)報(bào)道的化合物精準(zhǔn)分子量，初步確定色譜峰對(duì)應(yīng)的化合物，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各樣品乙酸乙酯提取物中化合物鑒定結(jié)果Tab.4 Identification results for compounds in ethyl acetate extract of various samples

3 討論與結(jié)論

《黃帝內(nèi)經(jīng)》 認(rèn)為，腫瘤是長(zhǎng)期經(jīng)絡(luò)氣血積聚、瘀滯導(dǎo)致邪阻絡(luò)脈所致的結(jié)果，符合久痛入絡(luò)、久病入絡(luò)的發(fā)病機(jī)制［17］。現(xiàn)代中醫(yī)也認(rèn)為，經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)與腫瘤病證發(fā)生發(fā)展及病證治療有著極為密切的聯(lián)系［18］。路路通果體多孔，歸肝、腎經(jīng)，有通行十二經(jīng)之功效，為通經(jīng)活絡(luò)的常用中藥。從中醫(yī)治療腫瘤的理論入手，找到路路通中抗腫瘤的活性單體，以期為疏經(jīng)通絡(luò)理論闡釋及中藥抗腫瘤研究提供參考。

本研究在前期路路通抗肝腫瘤藥效物質(zhì)確定的基礎(chǔ)上，圍繞活性部位抗腫瘤藥效單體篩選這一科學(xué)問(wèn)題，采用灰關(guān)分析、偏最小二乘回歸2 種分析，獲得了路路通抗腫瘤活性較強(qiáng)的1、2、4、12、16、19、21、25、26 號(hào)共9 個(gè)色譜峰，2 種分析方法相似性為75%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了2 種分析方法用于篩選藥效成分的合理性。分析2 種方法結(jié)果差異性的由來(lái)，可能與灰關(guān)分析方法僅僅標(biāo)識(shí)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)，但不表示其正促進(jìn)或是負(fù)抑制，而偏最小二乘回歸分析方法獲得是正促進(jìn)的藥效成分。

本課題組下一步將圍繞藥效單體成分定性、定量，藥理藥效評(píng)價(jià)，成分配伍及優(yōu)化開(kāi)展研究，期待較為全面的獲得路路通藥材抗肝腫瘤的藥效物質(zhì)，以期為其抗腫瘤藥物研發(fā)、臨床應(yīng)用及作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。