知母皂苷B?Ⅱ抑制秀麗隱桿線蟲Aβ 蛋白毒性作用及機制研究

宗茹敏王雅麗黃 琪 鄭良超徐國兵吳德玲*

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥230012； 2.中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽 合肥230012； 3.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230012）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種神經系統退行性疾病，表現為漸進性記憶減退、認知功能障礙，Aβ 的沉淀和聚集所形成的老年斑是AD 較明確 的致病因子。知母皂苷B?Ⅱ（timosaponin B?Ⅱ，TSB?Ⅱ）為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的主要成分與活性物質，可改善癡呆大鼠的學習記憶能力［1?2］，發揮抗癡呆作用。

秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans屬于線性動物門，具有生存周期短、易于培養操作等特點，已完成全基因組測序，約40%的基因與人類同源，而且神經細胞發達，有利于其用于神經方面的疾病研究。CL4176 線蟲在肌肉細胞中表達人類β?淀粉樣蛋白1?42（Aβ1?42），升高溫度可誘導Aβ1?42表達量增加，導致線蟲癱瘓，可通過線蟲癱瘓表型變化判斷藥物的有效性［3］。daf?16 mRNA 是與壽命胰島素daf?16／FOXO 信號通路相關基因，對線蟲壽命的延長起正向調節作用；sod?3 作為daf?16 的靶基因，可通過催化O2?的去除來保護機體免受氧化應激；skn?1 mRNA 表達也能在一定程度上延緩氧化損傷；hsp?16.2 作為一種經Aβ 誘導產生的低分子量多肽，可減輕毒性蛋白質累計造成的損傷，其過度表達抑制癱瘓表型的作用也已被證明。目前，關于TSB?Ⅱ抑制轉基因秀麗隱桿線蟲體內Aβ 聚集作用及機制鮮有報道，故本實驗以秀麗隱桿線蟲CL4176 為模型，通過線蟲癱瘓、壽命、體內活性氧水平、氧化應激、熱應激等實驗探討TSB?Ⅱ抑制Aβ 蛋白毒性作用及可能的機制，以期為AD 治療提供理論基礎。

1 材料

野生型秀麗隱桿線蟲N2、轉基因秀麗隱桿線蟲CL4176 ｛dvIs27 ［pAF29（myo?3／A?Beta 1?42／Iet UTR）＋pAF4（rol?6（su1006）］｝購于美國線蟲基因中心（CGC）；大腸桿菌（Escherichia coliOP50 株）受贈于中國科技大學生命科學院光壽紅教授。TSB?Ⅱ對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號100420，純度＞98%）。Aβ1?42（上海信裕生物工程有限公司，批號XY?E11405）；ECL 化學發光檢測試劑盒、BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0018AS、批號P0012S）；細胞蛋白裂解液（福州飛凈生物科技有限公司，批號PH0406）；Trizol（美國Life Technogies 公司，批號15596018）；DEPC?H2O（上海捷瑞生物工程有限公司，批號D1007）；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（美 國 Anovoprotein 公 司，批 號E096?01）；RevertAidTM firsStrand cDNASynthesis Kit（批 號K1622）、熒光定量PCR 儀（型號PIKOREAL 96）（美國Thermo Scientific 公司；體式顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司，型號Motic K?400C）；熒光酶標儀［美谷分子儀器（上海）有限公司，型號SpectraMax M4］；普通PCR 儀（杭州晶格科學儀器有限公司，型號K960）；引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司進行。

2 方法

2.1 NGM 固體培養基（線蟲生長培養基）與M9溶液的制備及線蟲同步化 參考文獻［4?5］ 報道的方法制備NGM 固體培養基與M9 溶液，對配置好的NGM 培養基進行鋪板，凝固后倒置，在4 ℃冰箱中保存。對線蟲進行同步化培養，然后將其轉移至NGM 培養皿中，于20 ℃培養箱中恒溫培養。

2.2 TSB?Ⅱ溶液制備 取適量TSB?Ⅱ，超純水溶解成960 μg／mL 母液，除菌濾頭過濾后加入大腸桿菌OP50 配置成質量濃度為640、160、40、10、2.5、0.625 μg／mL 的溶液，各取300 μL 鋪在NGM 板中，每個質量濃度鋪3 塊板。

2.3 癱瘓實驗 用M9 緩沖液將產卵期CL4176 線蟲洗至離心管進行離心處理，棄去上清液，重復3次后加入與M9 等體積的裂解液，待線蟲全部裂解后離心，棄去上清液，將蟲卵鋪在新的NGM 板中，于16 ℃下培養至孵化成蠕蟲后，轉移至TSB?Ⅱ的各給藥濃度組，升溫至25 ℃誘導Aβ1?42基因表達和線蟲癱瘓。用挑針輕觸線蟲，線蟲保持頭動而身體不動，則判定為癱瘓［6］。

2.4 壽命實驗 產卵期CL4176 線蟲同步化后，將蟲卵鋪于NGM 板中16 ℃孵化12 h 后轉移至TSB?Ⅱ的3 個最佳給藥濃度組（TSB?Ⅱ?40、TSB?Ⅱ?10、TSB?Ⅱ?2.5）及空白組培養，每個濃度平行3 塊板，每3 d 記錄線蟲存活情況，直至全部死亡為止，對其壽命做生長曲線，考察TSB?Ⅱ對轉基因線蟲是否有毒性作用［7］。用挑針輕觸線蟲頭部和尾部，若30 s 內均無反應，則判定為死亡。

2.5 活性氧（ROS）檢測 產卵期CL4176 線蟲同步化后，將蟲卵鋪在NGM 板上孵化，轉移至TSB?Ⅱ的3 個最佳給藥濃度組（TSB?Ⅱ?40、TSB?Ⅱ?10、TSB?Ⅱ?2.5）及空白組，于16 ℃培養36 h，升溫給藥板至25 ℃培養36 h，將線蟲于EP 管中用PBS 沖洗3 次后，在含H2DCF?DA 的PBS?T 中孵育3 h，每10 min 渦旋1 次，熒光酶標儀于溫度37 ℃、激發光波長485 nm、發射光波長530 nm 下測定熒光強度［8］，平行3 次。

2.6 Aβ 體外沉積實驗 將適量Aβ1?42用六氟異丙醇（HFIP）冰浴超聲10 min，溶解成質量濃度為1 mg／mL，吹去HFIP，將管內壁透明的肽層溶于DMSO 中，PBS 稀釋成濃度為0.025 mmol／L 的溶液。取Aβ 淀粉樣蛋白10 μL、不同濃度TSB?Ⅱ組20 μL，加到96 孔板中混合均勻后，于37 ℃下避光孵育，加入用0.1 mol／L 甘氨酸緩沖液200 μL（pH＝8.9）配制的0.01 mmol／L 的ThT 混勻顯色，采用熒光酶標儀，在激發光波長450 nm、發射光波長485 nm 下測量熒光強度［9］，平行3 次。

2.7 氧化應激實驗 挑取處于產卵期的N2 線蟲，在NGM 平板上產卵3 h。將孵出的蠕蟲轉移到空白組與不同濃度TSB?Ⅱ組，在20 ℃下培養至3 d后，轉移至含有胡桃醌（0.2 mmol／L）的NGM 板上，每隔1 h 觀察蠕蟲存活情況1 次，直至線蟲全部死亡［10?11］，平行3 次。

2.8 熱應激實驗 挑取處于產卵期的N2 線蟲，在NGM 平板上產卵3 h。將產下的卵孵出的蠕蟲轉移到空白組與不同濃度TSB?Ⅱ組板上，在20 ℃培養箱中培養3 d 后升溫至35 ℃，每隔1 h 觀察線蟲存活情況1 次，直至線蟲全部死亡［12］，平行3 次。

2.9 TSB?Ⅱ對過氧化氫酶的影響 線蟲同步化后蟲卵加到NGM 板上，置于16 ℃恒溫培養箱中孵化12 h，將蠕蟲轉移至空白組與不同濃度TSB?Ⅱ組板上，置于16 ℃恒溫培養箱中孵化24 h 后升溫至25℃孵化36 h，以誘導Aβ 基因表達。M9 緩沖液收集各組線蟲于EP 管內，蛋白裂解液（1 mmol／L PMSF）冰浴超聲提取線蟲體內總蛋白，BCA 法對蛋白進行定量分析，按照試劑盒操作步驟進行顯色，最后通過紫外酶標儀檢測，計算相應數值，平行3 次。

2.10 β 淀粉樣蛋白寡聚體的點印記分析 對線蟲體內各給藥組總蛋白進行定量分析后，計算不同濃度組蛋白含量，再確定不同濃度給藥組蛋白印跡分析時的上樣量，蛋白定量點樣在0.22 μm NC 膜上，自然揮干后在室溫下用TBST 配置的5%脫脂奶粉封閉1 h，1×TBST 于搖床上洗3 次，每次5 min，4 ℃下與一抗A11 孵育搖床振搖過夜，1×TBST 于搖床上洗3 次，將膜與過氧化物酶偶聯的二抗搖床振搖孵育1 h，1×TBST 于搖床上洗3 次，膜加入顯影液后放入凝膠成像儀中避光顯色并拍照，曝光時間根據膜曝光程度調整至最佳狀態，通過凝膠圖像處理系統分析光密度值。

2.11 實時熒光定量 重復“2.10”項下步驟誘導Aβ 基因表達，加M9 緩沖液沖洗2～3 次后離心，吸取上層緩沖液，蟲體放入－80 ℃冰箱中凍存數小時后，采用Trizol 法提取線蟲總RNA，取3 μg至EP 管中，按照試劑盒說明書使其進行逆轉錄反應，得到cDNA，于－80 ℃下保存備用。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.12 統計學分析 分析方法為 Relative Quantification Study，計算方法為2－△△Ct。通 過GraphPad Prism 6.01 軟件進行處理，Image J 軟件分析熒光強度，重復3 次，取平均值。

3 結果

3.1 TSB?Ⅱ對線蟲癱瘓、壽命、活性氧、氧化應激、熱應激等實驗的影響 如圖1a 所示，相比空白組，不同濃度TSB?Ⅱ組均有一定的抗線蟲癱瘓作用（P＜0.05），其中TSB?Ⅱ?40 組效果最佳，后期選取TSB?Ⅱ?40、TSB?Ⅱ?10、TSB?Ⅱ?2.5 組作進一步考察。如圖1b 所示，不同濃度TSB?Ⅱ組在一定程度上也可延長線蟲壽命（P＜0.05）。如圖1c所示，模型組線蟲體內ROS 高于不同濃度TSB?Ⅱ組、空白組，表明誘導Aβ基因表達后出現AD 表觀癥狀時，線蟲體內ROS 水平相比空白組是增加的；不同濃度TSB?Ⅱ組相比模型組，均能在一定程度上降低線蟲體內ROS 產生（P＜0.01）。如圖1d 所示，不同濃度TSB?Ⅱ組相比空白組，能延長線蟲死亡時間，以TSB?Ⅱ?40 作用最好（P＜0.05）。如圖1e～1f 所示，相比模型組，不同濃度TSB?Ⅱ組均能減弱線蟲受到的熱應激損傷作用（P＜0.05），但對轉基因線蟲體內過氧化氫酶無明顯影響（P＞0.05）。TSB?Ⅱ對線蟲癱瘓、壽命、氧化應激與熱應激實驗的影響見表2。

表2 TSB?Ⅱ數據秩和檢驗Tab.2 Kruskal?Wallis tests for TSB?Ⅱdata

3.2 TSB?Ⅱ對Aβ 體外聚集的影響 如圖2 所示，相比空白組，不同濃度TSB?Ⅱ組均能在一定程度上降低β 淀粉樣蛋白的聚集（P＜0.01）。

圖2 TSB?Ⅱ對Aβ 體外聚集的影響（， n＝3）Fig.2 Effect of TSB?Ⅱon the in vitro aggregation of Aβ（， n＝3）

3.3 TSB?Ⅱ對Aβ 體內聚集的影響 如圖3 所示，升溫誘導的線蟲灰度值最高；相比模型組，不同濃度TSB?Ⅱ組均能降低線蟲體內Aβ 聚集和沉積（P＜0.01）。

圖3 TSB?Ⅱ對Aβ 體內聚集的影響（， n＝3）Fig.3 Effect of TSB?Ⅱon the in vivo aggregation of Aβ（， n＝3）

3.4 TSB?Ⅱ對AD 相關基因表達的影響 如圖4所示，相比模型組，TSB?Ⅱ?40 組可上調sod?3、hsp?16.2、daf?16 mRNA 表達，下調skn?1、amy?1 mRNA 表達（P＜0.05，P＜0.01），而TSB?Ⅱ?2.5組sod?3 mRNA 表 達，TSB?Ⅱ?10、TSB?Ⅱ?2.5 組daf?16 mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05）。

圖4 TSB?Ⅱ對AD 相關基因表達的影響（， n＝3）Fig.4 Effects of TSB?Ⅱon the expressions of AD?related genes（， n＝3）

4 討論

AD 的治療與治愈是近年來研究的熱點，其主要病理學特征為大腦皮質萎縮和Aβ 沉積形成的老年斑，表現為漸進性記憶減退、認知功能障礙。但其發病機制并未完全闡明，目前國內外公認的學說有Aβ 沉積學說。Aβ 是由一個跨膜糖蛋白淀粉樣前體蛋白（APP）經β 和γ 分泌酶水解產生的一段中間肽鏈。有研究證明，Aβ 的過度產生以及促進Aβ 的聚集和沉積或抑制Aβ 沉積物的清除是導致阿爾茨海默病的主要原因之一。正常情況下Aβ的產生和消除處于動態平衡，當體內平衡遭到破壞時易引起Aβ 的沉淀和聚集，進而激發炎癥級聯反應，產生氧化應激作用于線粒體，影響能量代謝，加速Tau 蛋白磷酸化，神經纖維纏結的形成和降低興奮性閾值等途徑發揮神經毒性，因此調控Aβ 的形成與代謝對于AD 的預防和治療具有重要作用。SOD 作為常見抗氧化酶之一，能一定程度抵御氧化應激與清除體內活性氧。胰島素信號通路是重要的壽命調節通路，daf?16 mRNA 是調節衰老的下游組件，其大量表達能夠延緩衰老，延長線蟲壽命，sod?3 作為daf?16 的靶基因，可通過催化的去除保護機體免受氧化應激。小分子熱休克蛋白hsp?16.2 是一種低分子量多肽，存在大部分機體中，該基因的表達可促進細胞對新生Aβ 蛋白的清除從而減緩Aβ 蛋白的毒性。skn?1 mRNA 是與氧化誘導反應的轉錄因子，基因的表達可以調控抗氧化應激反應，一定程度上延緩氧化損傷。amy?1 mRNA可能協調參與升溫誘導后A 溫基因的表達導致的癱瘓。

本研究以秀麗隱桿線蟲CL4176 為模型，探討了不同濃度TSB?Ⅱ對線蟲癱瘓、壽命、活性氧、氧化損傷及熱應激損傷和Aβ 的產生、聚集等方面的影響，結果表明TSB?Ⅱ不同濃度給藥組均能一定程度上抗線蟲癱瘓、延長線蟲壽命、降低活性氧、減輕氧化損傷及熱應激損傷。通過藥物與Aβ1－42蛋白單體共孵育，發現藥物不同濃度組均能一定程度上降低Aβ 的體外聚集。通過Aβ 寡聚體的點印記分析、實時熒光定量PCR 分析發現TSB?Ⅱ可上調線蟲體內sod?3、hsp?16.2、daf?16 mRNA的表達和下調skn?1 和amy?1 mRNA 的表達，由此可知TSB?Ⅱ能夠增強秀麗隱桿線蟲CL4176 對于氧化應激和熱應激的耐受性，降低Aβ 蛋白的聚集和沉積，具有保護神經元的作用，其對Aβ 的產生、聚集的抑制作用可能與壽命胰島素信號通路相關。