原花青素對宮頸癌HeLa 細胞上皮間質轉化的抑制作用

張 蕾，黃華明，周 杰，聶 超*

（1.江蘇衛生健康職業學院，江蘇 南京211800； 2.無錫市錫山人民醫院，江蘇 無錫 214015）

宮頸癌是一種嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤，每年世界新增患者達幾十萬人。盡管宮頸癌疫苗的使用和篩查手段不斷更新，患病率已經降低［1］，但化療對術前縮小病灶增加手術機會、術后防止復發轉移及晚期轉移性宮頸癌仍起著不可替代的作用［2］。由于化療藥物缺乏理想療效、不良反應較強等問題［3］，中藥替代或與現有藥物聯合使用正成為當前新的趨勢。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是一種黃酮類化合物，廣泛存在于各種植物的核、皮、種籽等部位，在葡萄籽中含量最高，也是多種中藥的主要成分之一［4］，有著抗炎、降血壓、抗白血病、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等功效［5?6］，同時其來源廣泛，不良反應低，受到了人們廣泛關注。本實驗將原花青素作用于宮頸癌HeLa 細胞，觀察藥物對細胞侵襲和遷移的影響，并討論藥物抑制上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）產生作用的機制，以期為該成分開發利用提供參考。

1 材料

1.1 細胞株 人宮頸癌HeLa 細胞購于江蘇凱基生物技術股份有限公司（KG042），置于完全培養基（90%DMEM ＋10% CS）中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。

1.2 試劑與藥物 原花青素（南京澤朗生物科技有限公 司，ZL20170515012，純度＞ 98%）。SB431542（美國Sigma 公司，616464）；TRIzol（美國Invitrogen 公司，15596026）；氯仿（865?49?6）、異丙醇（67?63?0）（上海賢鼎生物科技有限公司）；MTT（北京索萊寶科技有限公司，IM0280）；Transwell 小室（美國Chemicon 公司，ECM550）；PBS（含EDTA）（KGY0012）、全蛋白抽提試劑盒（KGP250）、5×SDS?PAGE 蛋白上樣緩沖液（KGP101）、SDS?PAGE 凝膠配制試劑盒（KGP113）、Western?blot一抗TGFβ1（KGYT4632?6）、E?cadherin（KGYT1453?6）、Smad2（KG21323?2）、Smad3（KG21325?2）、pSmad2（KG11322）、pSmad3（KG11325?2）、內參一抗GAPDH（KGAA002－1）、二抗（KGP1201）、ECL檢測試劑盒（KGP1121）（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；Smad7（武漢三鷹生物技術有限公司，25840－1?AP）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測細胞增殖 將細胞配制成濃度為5×104／mL 的細胞懸液，96 孔細胞培養板中加入100 μL 細胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，完全培養基稀釋藥物至所需質量濃度（100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg／L），每孔加入100 μL 相應含藥培養基，同時設立陰性對照組、陽性對照組，將96 孔細胞培養板置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，進行MTT 染色，在490 nm 波長下測定光密度（OD）值，計算抑制率。

2.2 劃痕法檢測細胞遷移 將對數生長期的細胞配制成濃度為5×104／mL 的細胞懸液，接種到6 孔板中，加入相應的含藥無血清培養基，同時設立陰性對照組。次日，待細胞集合度達60% 左右后用無菌槍頭在6 孔板中均勻劃線，PBS 洗去漂浮細胞，換新鮮培養液，置于細胞培養箱中繼續培養，于12、24 h 取出細胞，拍照（放大倍數100×），測量細胞遷移距離。

2.3 Transwell 檢測細胞侵襲 將對數生長期的細胞配制成濃度為5×104／mL 的細胞懸液，接種到6孔板中。次日，待細胞貼壁后根據組別設置（100、50、25 mg／L）加入相應含藥培養基，同時設立陰性對照組，將Matrigel 基質膠在4 ℃下過夜融化，不完全培養基稀釋1 倍，Transwell 上室加入30 μL 稀釋的Matrigel，37 ℃下孵育120 min，使Matrigel 聚合成膠，不完全培養基調整細胞濃度至5×105／mL，取100 μL 細胞懸液加入Transwell 小室，下室加入500 μL 含20% FBS 的培養基，將24孔細胞培養板置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，棉簽擦去基質膠和上室內細胞，移去Transwells，倒置，風干，在24 孔板中加入500 μL 0.1%結晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒在染料中，37 ℃下反應30 min 后取出，PBS 清洗，直徑上取3 個視野，照相（×200），計數。

2.4 免疫熒光觀察蛋白變化 取對數生長期的細胞，調整細胞濃度至5×104／mL，根據組別設置（100、50、25 mg／L）加入相應含藥物的培養基，培養24 h 后將2 種細胞自然晾干，4%多聚甲醛固定液浸泡30 min，PBS 浸洗3 次，依次滴加3%H2O2?甲醇溶液2 滴、即用型山羊血清75 μL，室溫下孵育20 min。在37 ℃下滴加一抗（1 ∶100 稀釋）75 μL，孵育2 h，PBS 浸洗3 次；FITC（1 ∶200 稀釋）二抗75 μL，避光孵育1 h，PBS 浸洗3次，滴加DAPI 染液后用防萃滅封片膠封片，熒光顯微鏡下觀察細胞3 個高表達區域并拍照保存。使用Image?Pro Plus 6.0 軟件計算視野面積下光密度（IOD），求得平均光密度，公式為平均光密度＝IOD／視野面積。

2.5 Western blot 檢測蛋白表達 將對數生長期的細胞消化接種到6 孔板中，次日待細胞貼壁后，根據組別設置（100、50、25 mg／L）加入相應含藥培養基，同時設立陰性對照組，各組加入200 μL冰預冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30 min，常規渦旋后，14 000 r／min、4 ℃離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，10% SDS?PAGE 凝膠電泳分離，轉移到聚氟乙烯（PVDF）膜上，5% 脫脂牛奶過夜封閉，加入一抗（1 ∶200），過夜孵育于4 ℃封閉袋中，二抗（1 ∶4 000）孵育（辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體）1 h，其間每一步都用TBST洗膜3 次，每次10 min。凝膠成像系統成像，Gel?Pro32 軟件進行灰度分析。

2.6 熒光定量PCR 檢測基因表達 將對數生長期宮頸癌HeLa 細胞提取總RNA，測定純度后反轉錄為cDNA。用熒光染色法和熒光定量PCR 儀進行實時定量PCR，引物由江蘇凱基生物科技有限公司合成，序列分別為GAPDH primer（90 bp）［5′?AGATCATCAGCAATGCCTCCT?3′、5′?TGAGTCCTTC CACGATACCAA?3′］、E?cadherin primer（108 bp）［5′?CCAAGCAGCAGTACATTCTACA?3′、5′?CATT CACATCCAGCACATCCA?3′］，擴增條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火／延伸20 s，72 ℃變性40 s，共40 個循環，產物特異性用溶解曲線監 測。采 用 Rotor?Gene Real?Time Analysis Software 6.1 分析軟件及ΔΔCT法定量分析擴增曲線及溶解曲線，以GAPDH 為內參衡量靶細胞目的基因表達量。

2.7 統計學分析 通過SPSS 16.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 原花青素對HeLa 細胞增殖的影響 原花青素質量濃度在0～50 mg／L 之間時，對宮頸癌HeLa細胞的抑制率無明顯變化并較低，僅大約為10%，而且差異無統計學意義（P＞0.05）；從100 mg／L開始抑制率顯著提升，最高可達44.73%。為了避免原花青素由于抑制宮頸癌細胞而產生抑制侵襲遷移作用，劃痕、Transwell 實驗選取50 mg／L 作為其質量濃度。見圖1。

圖1 原花青素對HeLa 細胞增殖的影響（， n＝6）Fig.1 Effect of proanthocyanidins on HeLa cell proliferation（， n＝6）

3.2 原花青素對HeLa 細胞遷移的影響 對照組細胞保持了原有的遷移能力；原花青素干預后12、24 h 細胞遷移距離縮短，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 原花青素對HeLa 細胞遷移的影響（， n＝3，×100）Fig.2 Effect of proanthocyanidins on the migration of HeLa cells（， n＝3，×100）

3.3 原花青素對HeLa 細胞侵襲的影響 對照組在不同時間點穿模細胞數呈上升趨勢；50 mg／L 原花青素干預12、24 h 后，穿膜細胞數與對照組比較得到了抑制（P＜0.05，P＜0.01），并呈時間依賴性。見圖3。

圖3 原花青素對HeLa 細胞侵襲的影響（， n＝3，×200）Fig.3 Effect of proanthocyanidins on the invasion of HeLa cells（， n＝3，×200）

3.4 原花青素對HeLa 細胞中EMT 相關蛋白的影響 TGF?β1 蛋白光密度在對照組中最高，而不同劑量原花青素干預后降低（P＜0.05，P＜0.01）；E?cadherin 蛋白光密度在對照組中最低，而不同劑量原花青素干預后升高（P＜0.05，P＜0.01），并均呈濃度依賴性。見圖4。

圖4 原花青素對HeLa 細胞中EMT 相關蛋白的影響（， n＝3）Fig.4 Effect of proanthocyanidins on EMT?related proteins in HeLa cells（， n＝3）

3.5 原花青素對HeLa 細胞中TGF?β1、E?cadherin蛋白表達的影響 TGF?β1 蛋白表達在對照組中最高，而原花青素干預后降低（P＜0.05，P＜0.01）；E?cadherin 蛋白表達在對照組中最低，而原花青素干預后升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

圖5 原花青素對HeLa 細胞中TGF?β1、E?cadherin 蛋白表達的影響（， n＝3）Fig.5 Effects of proanthocyanidins on the protein expressions of TGF?β1 and E?cadherin in HeLa cells（， n＝3）

3.6 原花青素對Smad 蛋白表達的影響 原花青素對Smad2、Smad3 蛋白表達無明顯影響（P＞0.05），但對pSmad2、pSmad3 蛋白表達有抑制作用（P＜0.01），同時還可上調Smad7 蛋白表達（P＜0.01），并呈劑量依賴性。見圖6。

圖6 原花青素對Smad 蛋白表達的影響（， n＝3）Fig.6 Effects of proanthocyanidins on the protein expressions of Smads（， n＝3）

3.7 原花青素對E?cadherinmRNA 表達的影響加入10 μmol／L 抑制劑SB431542 后，E?cadherinmRNA 表達與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；100 mg／L 原花青素干預后，E?cadherinmRNA 表達降低（P＜0.01）。見圖7。

圖7 原花青素對E?cadherin mRNA 表達的影響（， n＝3）Fig.7 Effect of proanthocyanidins on the mRNA expression of E?cadherin（， n＝3）

4 討論

本實驗為了避免宮頸癌細胞增殖帶來的實驗誤差，采用了無血清培養基，并將實驗控制在24 h。同時為了避免原花青素是由于產生抑制宮頸癌細胞而產生抑制侵襲遷移作用，采用了MTT 實驗明確原花青素對宮頸癌細胞的用藥劑量，結果顯示原花青素質量濃度在50 mg／L 以下時細胞抑制率較低，因此劃痕和Transwell 實驗最終質量濃度確定為50 mg／L（圖1）。用藥后12、24 h，在原花青素的作用下HeLa 細胞侵襲和遷移能力出現了不同程度的減弱，并呈時間依賴性（圖2～3）。

EMT 是指上皮細胞在形態學上發生向間質細胞表型的轉變并獲得遷移能力的過程［7］。細胞失去極性，細胞的遷移和運動能力增強，同時細胞表型發生改變，出現間質細胞的特性，導致細胞間連接松散，使腫瘤細胞侵襲和遷移的能力增強［8］。EMT 是腫瘤細胞獲得遷移能力的方式之一，它是腫瘤細胞浸潤、轉移的重要途徑［9］。

EMT 形成的機制備受人們的關注，其中TGF?β 是被廣泛認可的調控EMT 過程的重要蛋白［10］。其主要通過Smad 依賴型和非Smad 依賴型兩條信號通路調控下游轉錄因子，參與EMT 的調控過程［11］。研究表明，TGF?β 是最早被發現能夠誘導腫瘤細胞EMT 過程發生的主要因素之一，其主要包括TGF?β1、TGF?β2、TGF?β3亞型，其中以TGF?β1 含量最高，與EMT 形成關系最為密切［12］。TGF?β1 在腫瘤細胞生長晚期可以促進腫瘤細胞的轉移，其促癌的作用通常與誘導腫瘤細胞EMT 同步發生［13］。多項實驗表明，腫瘤細胞里TGF?β1 的含量與促進腫瘤細胞遷移和侵襲正相關［14?15］。

E?cadherin 是維持上皮細胞極性和細胞間粘附的主要分子，其主要的功能是其可以形成蛋白復合體連接到肌動蛋白細胞骨架，阻止腫瘤細胞的轉移和侵襲［16］，而EMT 可以使上皮細胞粘附分子及細胞骨架成分減少或消失從而獲得間質細胞表型。因此，E?cadherin 表達減少或消失是腫瘤細胞產生EMT 的重要標志［17］。

為了證明原花青素抑制宮頸癌侵襲和遷移的能力與EMT 有關，本研究采用了免疫熒光技術，半定量分析用藥前后宮頸癌細胞內TGF?β1 和E?cadherin 的含量，實驗發現，在藥物作用下，宮頸癌HeLa 細胞中的TGF?β1 均出現了不同程度的降低，呈濃度依賴（圖4）。為了進一步觀察藥物作用與EMT 有關，同時也為了驗證免疫熒光的結果，采用Western blot 檢測了TGF?β1 和E?cadherin 蛋白表達的水平，采用軟件進行了定量分析。結果顯示原花青素可以降低TGF?β1 蛋白的含量，提高E?cadherin 蛋白含量，從而抑制宮頸癌EMT 的形成（圖5）。

此外，TGF?β／Smads 信號的激活與腫瘤密切相關，TGF?β／Smads 信號通路在腫瘤發生晚期可促進腫瘤細胞的生長、浸潤與轉移。Smad 蛋白是TGF?β1 受體的結合蛋白，介導細胞內TGF?β 信號的傳導［18］。可以分為以下3 類：受體結合的Smad（R?Smad）、Co?Smad（Smad4）和抑制 性Smad（I?Smads）。Smad2、Smad3 屬于受體結合的Smad［19］。TGF?β 與TGF?β 受體Ⅱ（TGF?βRⅡ）結合，可以磷酸化細胞內下游轉錄因子Smad2 和Smad3，磷酸化的Smad2、Smad3 與Smad4 結合形成異源復合物，轉移到細胞核內并在核內積累，形成轉錄復合物與其他轉錄因子協同作用［20］。Smad7 屬于TGF?β 受體拮抗蛋白，一旦激活后可以阻止Smad2／3 產生磷酸化，抑制Smad2／3 的活性，Smad7 可以負反饋調節TGF?β 對胞核靶基因轉錄的影響，進而抑制由TGF?β 信號引起的細胞產生的EMT 作用［21］。

為了找出原花青素抑制宮頸癌細胞EMT 的作用靶點，本研究通過Western blot 檢測了Smad 通路相關蛋白后發現，原花青素對HeLa 細胞沒有磷酸化的 Smad2、Smad3 沒有影 響，對磷酸 化Smad2、Smad3 蛋白產生了抑制作用，同時還可以上調Smad7 蛋白含量（圖6）。在聯合Smad 通路抑制劑SB431542 的作用下，原花青素對EMT 下游指標E?cadherin的作用出現降低，提示原花青素可以通過Smad 通路抑制宮頸癌細胞EMT 的產生（圖7）。

綜上所述，原花青素在體外作用人宮頸癌HeLa 細胞可以通過下調TGF?β1 和上調E?cadherin蛋白含量抑制宮頸癌細胞產生EMT，進而抑制宮頸癌細胞的侵襲遷移能力。其作用機制與抑制TGF?β1 介導的Smad 依賴性通路中的Smad2／3 產生磷酸化，增強Smad7 蛋白含量有關。原花青素有望成為作為臨床宮頸癌化療的輔助用藥。