霍山石斛花總黃酮微波輔助提取工藝的優(yōu)化

吳進東，董欣華，朱旺生，張國星

（皖西學院，安徽 六安 237012）

霍山石斛屬蘭科石斛屬植物，產(chǎn)于大別山區(qū)安徽霍山及其鄰近地區(qū)，是我國名貴中藥［1］。石斛屬植物花中含有豐富的黃酮［2］，具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血壓、清熱解毒等作用［3?5］，其提取方法主要包括水提［6］、堿提［7］、有機溶劑提取［8］、超聲波提?。??10］、超臨界流體提?。?1］、酶輔助提取［12］等，但都具有一定局限性，而微波輔助提取是一種快速高效、安全環(huán)保的提取方法［13?18］。本實驗針對現(xiàn)有霍山石斛花總黃酮提取工藝存在的不足，采用微波輔助提取，并對其進行優(yōu)化，以期為該藥材開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

UV?1800 紫外可見分光光度計（日本島津公司）；UWave?2000 多功能微波合成萃取儀（上海新儀微波化學科技有限公司）；TDL?4 臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；中藥粉碎機（瑞安市百信藥機器械廠）?；羯绞ㄓ赏钗鲗W院植物園植物細胞功能中心提供，經(jīng)皖西學院陳存武教授鑒定為正品。蘆丁對照品（南京杜萊生物科技有限公司）。乙醇、NaOH、亞硝酸鈉、硝酸鋁等為分析純。

2 方法

2.1 原料預處理 參考葸玉琴等［8］報道的方法，霍山石斛花除雜后用蒸餾水洗凈，吸水紙吸干，置于105 ℃烘箱中殺青20 min，80 ℃下烘干至恒重，粉碎成粉末，過40 目篩，貯藏于干燥箱中備用。

2.2 總黃酮提取 參考葸玉琴等［8］報道的方法，準確稱取1.0 g 粉碎的樣品，置于50 mL 三角瓶中，加入一定體積分數(shù)乙醇進行微波輔助提取，靜置冷卻后抽濾，加入相應體積分數(shù)的乙醇洗滌濾餅，合并濾液，離心，取上清液，紫外分光光度儀測定其吸光度。

2.3 線性關系考察 參考易建華等［12］報道的方法，精確稱取120 ℃下干燥至恒重的蘆丁對照品20 mg 左右，置于100 mL 量瓶中，60%乙醇溶解稀釋至刻度，精確量取25 mL，置于50 mL 量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得0.10 mg／mL 標準溶液。吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于6 支10 mL 具塞試管中，加30% 乙醇至5 mL，精確加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min 后加入1 mol／L NaOH 溶液4 mL，加水0.4 mL，搖勻，放置15 min，以第一管為空白，于510 nm 波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標（A），總黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，得方程為A＝9.176 9X－0.119 0（R2＝0.999 8）。

2.4 總黃酮提取量測定 取適量待測液于比色管中，按“2.3”項下回歸方程測定總黃酮質(zhì)量濃度，計算提取量［10］，公式為提取量＝C×V×n／m，其中C表示待測液中總黃酮質(zhì)量濃度，V表示提取液總體積，n表示稀釋倍數(shù)，m表示樣品質(zhì)量。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗 本實驗選擇乙醇體積分數(shù)、微波時間、微波溫度、液料比作為影響因素，水平分別為30%、45%、60%、75%、90%，1、2、3、4、5 min，50、60、70、80、90 ℃，20 ∶1、35 ∶1、50 ∶1、65 ∶1、80 ∶1，考察它們對總黃酮提取量的影響，結(jié)果見圖1～4。由此可知，各因素對總黃酮提取量都有明顯影響，而且均呈先升后降的趨勢，其中乙醇體積分數(shù)適宜水平在75% 左右，微波時間在2～4 min 之間，微波溫度在60～80 ℃之間，液料比在35 ∶1～80 ∶1 之間。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

圖2 微波時間對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of microwave time on extraction yield of total flavonoids

圖3 微波溫度對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of microwave temperature on extraction yield of total flavonoids

圖4 液料比對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of liquid?solid ratio on extraction yield of total flavonoids

3.2 響應面法 在“3.1”項下結(jié)果基礎上，采用響應面法作進一步優(yōu)化，設定乙醇體積分數(shù)（A）水平分別為50%、65%、80%，微波時間（B）水平分別為2、3、4 min，微波溫度（C）水平分別為55、70、85 ℃，液料比（D）水平分別為40 ∶1、55 ∶1、70 ∶1，總黃酮提取量（Y）作為評價指標，結(jié)果見表1。

對表1數(shù)據(jù)進 行擬合，得到方程為Y＝－96.436 167＋1.707 156A＋8.960 333B＋0.619 467C＋0.559 756D－ 0.022 000AB－ 0.016 222AC＋0.000 044AD＋ 0.010 667BC－ 0.006 333BD－0.002 766CD－ 0.011 487A2－ 1.299 500B2－0.002 642C2－0.003 020D2，方差分析見表2。由此可知，模型影響顯著（P＜0.01），失擬度不顯著（P＞0.05），表明其擬合度高；決定系數(shù)R2＝0.955 3，＝0.910 6，變異系數(shù)CV ＝4.28%＜5%，表明該模型重復性好；各因素影響程度依次為乙醇體積分數(shù)＞微波溫度＞料液比＞微波時間，其中乙醇體積分數(shù)極顯著（P＜0.01），微波溫度、液料比顯著（P＜0.05），微波時間不顯著（P＞0.05）。

表1 試驗設計與結(jié)果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

通過Design expert 8.0.6 軟件進行響應面分析，結(jié)果見圖5。由此可知，隨著乙醇體積分數(shù)、微波時間、微波溫度、液料比增加，總黃酮提取量均呈先升后降的趨勢，以乙醇體積分數(shù)、微波溫度、液料比更明顯（P＜0.05），與單因素試驗結(jié)果吻合；微波溫度與液料比的響應面最陡峭，說明兩者有顯著互作效應，與方差分析結(jié)果一致。最終確定，最優(yōu)工藝為乙醇體積分數(shù)66.30%，液料比56.37 ∶1，微波溫度73.64 ℃，微波時間3.05 min，總黃酮提取量12.41 mg／g，考慮到操作方便，將其修正為乙醇體積分數(shù)66%，液料比56 ∶1，微波溫度74 ℃，微波時間3 min。按上述優(yōu)化工藝進行6 批驗證試驗，測得總黃酮平均提取量為12.23 mg／g，與預測值12.41 mg／g 接近（相對誤差為1.45%），表明該工藝穩(wěn)定可行。

圖5 各因素響應面圖Fig.5 Response surface plots for various factors

4 討論

近年來，微波輔助技術因其具有加熱均勻、省時高效、節(jié)能環(huán)保、操作簡單的特點，在提取植物黃酮類物質(zhì)中被廣泛應用。微波輻射能改變提取液中極性分子的取向，活化黃酮分子，使其更易于提取［19］，當乙醇與提取物質(zhì)極性越接近時，提取物析出量越大，而前者極性與其體積分數(shù)呈負相關［20］。單因素試驗結(jié)果表明，乙醇體積分數(shù)在75%左右較適宜，此時溶液極性與總黃酮極性接近，可使提取量最高；微波時間、微波溫度分別在2～4 min，60～80 ℃之間較適宜，微波輻射可使細胞內(nèi)部溫度迅速上升，破壞細胞壁及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)活性成分更容易溶出，從而提高黃酮提取效率［20］；在一定范圍內(nèi)，總黃酮溶出量隨著微波時間延長、微波溫度增加而升高，但時間過長、溫度過高時其結(jié)構(gòu)易被破壞，同時雜質(zhì)溶出率增加［9］；液料比在30～80 倍之間較適宜，在一定范圍內(nèi)其數(shù)值越大，黃酮越容易被充分溶解出來，提取率也越高，但過大時雜質(zhì)溶出也會增加［9］。最終確定，霍山石斛花總黃酮最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)66%，微波時間3 min，微波溫度74 ℃，液料比56 ∶1，總黃酮提取量為12.23 mg／g。